Co により Ca2+ の流出が促進される

Communications Biology volume 6、記事番号: 573 (2023) この記事を引用

251 アクセス

1 オルトメトリック

メトリクスの詳細

Ca2+ は重要なシグナル伝達メッセンジャーです。 微生物、菌類、および植物では、H+/Ca2+ 対向輸送体 (CAX) が、細胞膜を通過する Ca2+ の流出を触媒することにより、細胞内 Ca2+ の恒常性において重要な役割を果たすことが知られています。 今回我々は、細菌の CAX ホモログ YfkE が 2 つの異なるモードで Ca2+ を輸送することを明らかにしました。1 つは低フラックス H+/Ca2+ 交換モード、もう 1 つは高フラックス モードです。 H+。 リン酸塩とのカップリングにより、YfkE の Ca2+ 流出活性が大幅に加速されます。 私たちの研究は、Ca2+とリン酸が中心転座経路の隣接部位に結合することを明らかにし、このCAXがどのようにして保存されたアルファリピートモチーフを変化させて、Ca2+転座の特異的な「輸送シャペロン」としてリン酸を採用するかを説明する機構的な洞察につながる。 この発見は、CAX ファミリー内の共輸送機構を明らかにし、このクラスのタンパク質が Ca2+ とリン酸の両方の細胞恒常性に寄与していることを示しています。

カルシウムイオンは自然界で最も豊富な金属イオンの 1 つであり、細胞内の多くの重要な機能に不可欠であり、Ca2+ は多用途のメッセンジャーとして機能します 1,2。 Ca2+シグナルは通常、選択的膜チャネルを介した細胞質へのCa2+流入によって開始され、小胞体などの細胞内小器官からのCa2+流出によってさらに増強されます。 しかし、サイトゾル Ca2+ の高レベルが持続すると致死的になります。 カルシウム陽イオン対向輸送体 (CaCA) は、Ca2+ 恒常性を回復する鍵となります。 H+/Ca2+ 対向輸送体 (CAX) および Na+/Ca2+ 交換体 (NCX) を含むこの膜輸送体のファミリーは、膜貫通電気化学勾配を下る H+ または Na+ の流入を動力源として、細胞質ゾルから Ca2+ を隔離し、積極的に輸送します 3,4。

CAX は細菌、菌類、植物に遍在しています3。 たとえば、CAX1-3 として知られる 3 つの CAX ホモログがシロイヌナズナで同定されており、リンゴの木では他の 20 以上が同定されています 3,5。 植物細胞では、CAX タンパク質は血漿膜と液胞膜の両方に存在し、寒さ、塩分、土壌の pH 変化などのさまざまな刺激に応答して、細胞質の Ca2+ が細胞から出たり酸性液胞に戻ったりするのを促進します 5,6。 7、8。 CAX ホモログも微生物中に遍在していますが、その生理学的役割についてはさらなる研究が必要です。 Ca2+ は、走化性、細胞分裂、胞子形成など、広範囲の細菌プロセスに関与しています。9 Ca2+ シグナル伝達は、細菌感染や宿主と病原体の相互作用にも関与しています 10。 CAX タンパク質は細菌の主要な Ca2+ 流出システムであると思われるため、これらのプロセスで中心的な役割を果たす可能性があります。 したがって、CAX の輸送機構を解明することは、これらの生物が Ca2+ の摂動やシグナル伝達に応答してどのように Ca2+ バランスを維持するかを理解するのに役立ちます。

構造的には、すべての CAX タンパク質は、11 個の膜貫通 (TM) ヘリックスからなる共通の基本構造を共有しているようです。 α-リピートと呼ばれる 2 つの保存された配列モチーフがヘリックス TM2-3 および TM7-8 に見られ、H+ および Ca2+ 認識のための部位を提供すると思われます。 最近、X 線構造により、このクラスの対向輸送体、すなわち枯草菌の YfkE、出芽酵母の VCX1、古細菌古細菌の CAX_Af の機構の分子基盤が明らかになり始めています 11,12,13。 これらの構造は、ヘリックス TM2-3 と TM7-8 が、膜のどちらかの側に H+ と Ca2+ の認識部位を交互に露出させる異なる配置をとる機構を示唆しています。 しかし、これら 3 つの構造は、交互アクセス機構における同様の状態、つまり、H+/Ca2+ 交換活性に重要な 2 つの保存されたグルタミン酸残基が中心イオンに隣接して位置する、内側に開いた状態 (つまりサイトゾルに対して) を捉えています。 -結合部位。 これら 2 つのカルボン酸残基は、VCX1 構造内の 1 つの Ca2+ イオンに配位します 11。 YfkE と CAX_Af の構造がリガンドのない状態を捉えているのか、それとも H+ に結合している状態を捉えているのかはすぐには明らかではありませんでしたが、2 つのカルボキシレート残基 (YfkE の E72 および E255) は、VCX1 の Ca2+ 結合状態と比較して異なる立体構造を採用しています。 最近、YfkE に関する我々の研究により、その交互アクセス機構が細胞内 Ca2+ ミニセンサーへの Ca2+ 結合によってアロステリックに調節されていることも明らかになりました 12。

ここで我々は、YfkE、そしておそらく他のCAXファミリーメンバーの一種のCa2+輸送機構を明らかにする。 我々は、YfkE が H+ と引き換えに Ca2+ と無機リン酸 (Pi) が 1:1 の比率で共転座する輸送モードを特徴とすることを実証します。 Piとのカップリングにより、YfkEは低流束対向輸送体から高流束対向輸送体に変換されます。 この Ca2+-Pi 共輸送メカニズムについての洞察を得るために、私たちはコンピューター シミュレーションや実験ベースの分子モデリングと組み合わせて、複数の生化学的および生物物理学的アプローチを利用します。 我々の結果は、Ca2+ と Pi がトランスポーター内部の共有認識部位 (E72 と E255 および近隣の他の極性残基を含む) に結合するという結論に導きました。 しかし、E72 と E255 は代わりに H+ に結合することができ、YfkE が H+ 勾配を利用して Ca2+ と Pi の輸送を促進する能力を説明します。 私たちの結果はまた、なぜ Pi 陰イオンの移動が Ca2+/H+ 交換反応を加速するのかを合理的に説明することを可能にします。

パイは重要な栄養素であり、ヌクレオチド、エネルギー、リン脂質の合成のために細胞内に豊富に含まれています。 トランスポータータンパク質が Ca2+ と Pi の膜移行を同時に促進する例を示します。 我々の発見は、CAXファミリー内の独特の輸送モードを明らかにするだけでなく、細胞内のCa2+とリン酸の両方の恒常性におけるその生理学的役割も示唆しています。

YfkE の特徴付けを開始するために、NADH を添加して外向きの H+ 勾配を確立した後、電子伝達系による小胞への H+ ポンピングを活性化した後、インサイドアウト小胞を使用してその Ca2+ 輸送活性を測定しました。 予想通り、結果として得られた時間経過は、Ca2+がYfkE小胞に輸送されたことを示しました（図1a）。 観察された輸送活性はミカエリス・メンテン反応速度論モデルによく適合し、KM = 69 μMおよびVmax = 4.2 μmol/min/gが得られました（図1b）。 驚くべきことに、5 mMの無機リン酸塩（Pi）を外部溶液（すなわち、小胞の細胞内側）に添加すると、YfkEのCa2+輸送活性が8倍に強力に加速されました（図1a）。 具体的には、速度論的分析により、KM = 198.7 μMおよびVmax = 33.3 μmol/min/gであることが明らかになりました（図1b）。 対照的に、硝酸塩、硫酸塩、ヒ酸塩、バナジン酸塩などの Pi 類似体 (補足図 1)、または ATP (補足図 2) に対しては効果が観察されず、YfkE による Ca2+ 輸送の加速が Pi によって特異的に媒介されることを示しています。 。 中性 pH におけるリン酸カルシウム化合物の主要な形態である Ca(H2PO4)2 は、水溶液によく溶けることは注目に値します。 一貫して、Piが存在する場合でもYfkEを欠く対照小胞ではCa 2+ の蓄積は観察されず（図1a）、Ca 2+ とPiが沈殿を形成する可能性は排除されました。 これらの結果は、YfkE がサイトゾル Pi の利用可能性を活用して、その H+/Ca2+ 対港活性を上方制御することを示しています。

インサイドアウト小胞を使用して測定された 45Ca2+ 輸送アッセイ (+/- Pi)。 小胞を 5 mM Pi と混合した後、0.5 mM 45CaCl2 を添加して室温で反応を引き起こしました。 空の小胞を対照として使用した。 b YfkE の Ca2+ 輸送の動態解析 (+/-5 mM Pi)。 データをそれぞれの対照小胞で減算し、GraphPad 9 を使用して Michalis-Menten 反応速度論に当てはめました。エラーバーは標準偏差を表します (n = 3)。

これらの観察により、我々は、Ca2+ と Pi が同時輸送されるため、Pi が YfkE の活性を刺激するという仮説を立てました。 我々の知る限り、他の CAX 対向輸送体では Pi 輸送は観察されていませんが、他のタンパク質ファミリーではカチオンと Pi の共輸送が報告されています。 たとえば、Na+/Pi シンポーター SLC34 は、Na+ 勾配を使用して Pi の取り込みを促進します14。 この仮説を検証するために、基質として 32P-リン酸カリウムを使用して Pi 輸送を測定しました。 図2aに見られるように、Piは時間依存的にYfkE小胞に輸入されました。 Ca2+輸送アッセイ（図1a）と一致して、Piの取り込みはCa2+（+0.5mM）の存在下でのみ観察され、Ca2+が存在しない場合には流入は検出されませんでした（図2a）。 同様に、Ca2+の存在下でも非存在下でも、YfkEを欠く対照小胞ではPiの取り込みは検出されませんでした（図2a）。 これらの結果は、YfkE が Ca2+ と Pi の共輸送を触媒するという仮説を立てました。

インサイドアウト小胞（+/- 0.5 mM Ca2+）を使用して測定されたYfkEのPi輸送の時間経過。 5 mM 32Pi 基質を反応液に添加しました。 空の小胞を対照として使用した。 b 精製された YfkE タンパク質のクーマシー染色 SDS-PAGE 画像。 c トロンビンで処理したプロテオリポソームにおける YfkE の配向の評価。 イムノブロットは、抗 His 抗体を使用して開発されました。 d 32Pi輸送アッセイは、再構成プロテオリポソームを使用して測定され、YfkEが2mM EDTAの存在下ではなく、0.5mM Ca2+の存在下でPiをインポートすることが示された。 エラーバーは標準偏差を表します (n = 3)。

上記の小胞アッセイは、この活性はYfkEを欠く対照小胞でも観察されなかったため、YfkEがCa 2+ とPiの共輸送に必要であることを示しています（図1aおよび2a）。 他のイオン輸送タンパク質が関与することなくYfkE単独がこの活性を媒介することを確認するために、YfkEを精製し、それをプロテオリポソームに再構成しました（図2b、cおよび補足図3）。 トロンビンは細胞内表面上の YfkE の N 末端 His タグを除去するため、限定タンパク質分解によって評価すると、これらのプロテオリポソームにおける YfkE の配向は右サイドアウトである可能性があります（図 2c および補足図 3）。 輸送反応を開始するために、プロテオリポソーム (pH 7.4) をより高い pH 緩衝液 (pH 8) で希釈することによって外向きの pH 勾配を確立し、P32-リン酸を使用して H+ 共役 Pi の取り込みを測定しました。 結果は、YfkEが0.5 mM Ca2+の存在下でプロテオリポソームにPiを取り込むが、Ca2+の非存在下（+2 mM EDTA）では取り込まないことを明らかに示しました（図2d）。 これらの結果は、我々の小胞アッセイを検証し、YfkE 単独が H+ と引き換えに膜を越えて Ca2+/Pi を共輸送することをさらに確認します。

共輸送機構に従って、Ca2+濃度が0.5 mM（図2a）から0.1 mM Ca2+（図3a）に低下すると、YfkE WTのPi輸送活性は大幅に減少しました。 同じ小胞内で観察された各種の輸送速度の比較は、このカップリングの化学量論が 1 Ca2+:1 Pi であることを示しています (図 3b、c)。 しかし、輸送速度論の分析に基づくと、Ca2+と比較して、Piの見かけの結合親和性ははるかに弱い（KM = 4.9 mM）（図3dおよび表1）。 Pi 基質結合は、放射性標識 32Pi 結合アッセイを使用して実証されました。 結果は、PiがYfkE WTタンパク質に結合していることを示しましたが、それはE72AおよびE255Aの変異によって破壊されました（図3e）。 Pi結合は等温滴定熱量測定（ITC）によってさらに特徴付けられ、輸送速度論分析から生成されたKM値（図3d）と一致して〜1 mMの結合親和性（図3f）が得られました。 上記の輸送アッセイと合わせて、これらすべてのインビトロ特性評価は、集合的に、Pi が実際に YfkE の共輸送基質であることを確認します。

インサイドアウト小胞を使用して 32Pi 輸送アッセイを測定したところ、WT とは対照的に E72A (赤い四角) および E255A の活性が示されませんでした。 アッセイは0.1 mM Ca2+の存在下で実施した。 b 示された時点で同じ YfkE 小胞内で測定された Ca2+ または Pi 輸送速度。 c 輸送速度を比較することによる Ca2+ と Pi の化学量論 (b)。 d 示されたサイトゾルpH条件におけるYfkE (+0.1 mM Ca2+)のPi輸送動態。 データを (-) コントロールで差し引いた後、GraphPad 9 を使用して Michalis-Menten 反応速度論に当てはめて KM と Vmax を計算しました。 e Ni-NTA ビーズに固定化された精製 YfkE タンパク質野生型、E72A、および E255A を使用した放射性標識 32Pi 結合アッセイ。 f YfkE への Pi 結合の ITC 分析。 10 mM Pi を YfkE タンパク質溶液に滴定しました。 Origin ソフトウェアを使用した反応速度モデルのフィッティングにより、0.93 ± 0.36 mM の結合親和性が得られます。 g 示されたpHで測定されたYfkEのPi輸送速度パラメータ（KMおよびVmax）。 エラーバーは標準偏差を表します ((a、d、e、g) では n = 3、(b、c) では n = 4)。

これらのデータを総合すると、YfkE は 2 つの異なるモードまたはメカニズムを使用して Ca2+ 流出を触媒すると結論づけられます。 もう1つは細胞内Piが十分に豊富な場合の高速モードで、Ca2+とPiの共輸送を伴います。 重要なのは、どちらの場合でも、Ca2+ 輸送には、交互アクセス モデルに従って電気化学的勾配を下る H+ の逆輸送が必要であるということです。 したがって、H +イオノフォアカルボニルシアン化物m-クロロフェニルヒドラゾン（CCCP）を輸送アッセイに追加すると、Piの非存在下または存在下で、インサイドアウト小胞へのCa2+取り込みが完全に排除されました（補足図2）。

溶液中では、Pi は pH に応じてさまざまなイオン化状態で存在できます。 特に、モノアニオン性 H2PO41- とジアニオン性 HPO42- の間の平衡の pKa は 7.2 です。 どの種の Pi が YfkE によって Ca2+ と一緒に輸送される可能性が最も高いかを評価するために、外部 pH を変化させ、つまり、外側への H+ 勾配の大きさだけでなく、Pi の内側から外側への小胞への Pi の取り込みを測定しました。イオン化平衡。 予想通り、外部 pH が 6.5 から 7.5 に増加すると、Pi の取り込みは加速しました。これは、おそらく下り坂の H + 流出によるより強い推進力を反映していると考えられます (図 3g)。 しかし、より高い pH 値では、輸送は明らかに徐々に阻害され、YfkE がジアニオン性 Pi を認識できず、モノアニオン性 H2PO41- を認識できることを示しています。

Ca2+ とは異なり、タンパク質構造における典型的な Pi 結合モチーフの明確な定義はありません。 しかし、Pi 結合は、正に荷電した残基 (アルギニンおよびリジン) およびスレオニン、セリン、ヒスチジンなどの極性残基によって有利に寄与されることが知られています 15。 E72、E255および周囲の極性残基によって形成されるYfkE内部のCa2+認識部位は、タンパク質の膜貫通ドメインにおけるPi認識に適した唯一の領域です（補足図4a）12。 たとえば、細胞内タンパク質表面の2つの正に荷電した残基であるR4およびR46によって媒介されるPi転座の代替経路を同定する試みは、Pi輸送活性に変化をもたらさなかった（補足図4b、cおよび表1）。 上述したように、放射性標識Pi結合アッセイは、Ca2+を配位することが知られている2つの残基の変異もPi結合を破壊することを示し（図3e）、これらの2つのイオンがタンパク質内の共有認識部位で互いに近接して結合することを示している。

この仮説をさらに検証するために、発光共鳴エネルギー移動 (LRET) に基づくアッセイを開発しました。 LRET 測定は、蛍光ドナーとそのアクセプターの間の距離の変化を報告し、異なる寿命の発光シグナルとして現れます。 このアプローチを通じて、我々は、Ca2+ と Pi の認識が YfkE 上で同等の構造変化を誘発するかどうかを確認しようとしました。 上記の機能アッセイと同様に、これらの測定は、ネイティブの膜環境にあるタンパク質を調べるために、インサイドアウト小胞内で実行されました (詳細については「方法」を参照)。 具体的には、チオール反応性化学を使用して、位置G56（細胞内TM1-2ループ）とC3（アミノ末端）をそれぞれテルビウムキレートとAtto-465で標識しました（図4a）。 LRETの結果に基づくと、基板が存在しない場合のドナーとアクセプター間の距離は25.5±0.2Åです（図4b）。 0.5 mM Ca2+ または 5 mM Pi を小胞に添加すると、距離は同様に 26.9 ± 0.3 Å に増加しました。 この結果を検証するために、C3にAtto-465アクセプターを維持しながら、（TM6の）S202の位置にテルビウムキレートドナーを導入しました（図4d）。 G56で観察されたように、Ca2+またはPiを添加すると、ドナーとアクセプター間の距離が同様に26.3±0.1Åから27.7±0.2または28±0.2Åに増加しました（図4e）。 重要なことに、G56C 変異体と S202C 変異体は両方とも、Pi の存在下で Ca2+ 取り込み活性を保持していました（補足図 5）。 したがって、LRET によって検出される距離変化は、基質結合によって誘発されるタンパク質の構造変化を反映している可能性があります。 確かに、ドナーとアクセプターの位置が最適ではないため、これらの変化は控えめであり、したがって、このデータによってどのようなタンパク質の動きが表されているかを識別することはできません。 ただし、これらの違いは統計的に有意であり、特に Ca2+ または Pi によって引き起こされます。 実際、Pi 類似体である 5 mM 硫酸塩を添加しても変化は観察されませんでした (図 4c、f)。 結論として、LRET 測定は、Ca2+ と Pi の両方がタンパク質内の共通の認識部位にアクセスするという我々の仮説を裏付けています。

a、d N末端C3のドナー（青い球）とTM1のG56C（オレンジ）（a）またはTM6のS202Cのレセプター（赤い球）の間の距離（赤い破線）を測定するLRET実験デザインのテーマ（マゼンタ）（d）。 経路を形成するヘリックスは緑色で表示されます。 トロンビンの切断 (ハサミで示されている) によりドナーが除去され、生の膜のバックグラウンドが計算されます。 青い矢印は、膜内のらせん構造の変化を示します。 b、c、e、f それぞれのバックグラウンドを差し引いた後の LRET トレース: アポ型 (黒)、+0.5 mM Ca2+ (青)、+5 mM Pi (赤)、および 5 mM 硫酸塩 (緑)。 b、c G56C。 e、f S202C。

これらの生化学的および生物物理学的測定に構造的コンテキストを提供するために、我々は分子モデリングに頼りました。 具体的には、結合イオン対向輸送体の標準であるように、YfkE が H+ と競合する形で Ca2+ と Pi の両方をどのように認識するかを説明する仮説モデルを構築しようとしました。 このプロセスの最初のステップは、内向き YfkE12 の既存の構造が H+ 結合状態を捕らえているかどうかを判断することでした。 もしそうであれば、この実験構造は Ca2+ と Pi に結合した状態をモデル化するための優れた基盤を提供すると考えました。 実際、膜対向輸送体の入手可能な構造データは、同じ機能状態の別の基質結合型は主に基質結合部位を形成する側鎖の構成が異なり、タンパク質骨格には大きな変化がないことを示している。

そのために、トランスポーター内部で選択した側鎖のプロトン化の可能性を定量化するように設計された一連の全原子分子動力学シミュレーションを実行しました（補足図6）。 具体的には、αリピート内の中央経路にある3つのプロトン化可能な残基であるE72、E255、およびH256に焦点を当てました（図5a）。 H256 は、H+ 結合 CAX では保存されているが、Na+ 結合 NCX では保存されていないため、H+ 結合に関与すると以前に予測されていました 12。 陰性対照として、タンパク質表面に露出しているため、所定の pH において溶液中での固有のプロトン化傾向から大幅に逸脱すると予想される E233 および H226 もプローブしました。 表2に要約されているように、我々の結果は、E72とE255の両方がYfkEの既存の内向き構造において同時にプロトン化されていることを強く示している。 プロトン化状態と脱プロトン化状態を個別に比較すると、溶液中のこのタイプの側鎖に固有のものと比較して、結晶構造に捕捉された特定の幾何学的形状において前者の方が非常に強く優先されることが最も明らかです。 (言い換えれば、この特定の立体構造における E72 と E255 の両方の「見かけの pKa」は、上方に強くシフトしています。) この傾向は、E255 よりも E72 の方がかなり大きく、E72 が内向き状態で脱プロトン化する最後の部位であることを示唆しています。 。 E72 がプロトン化されている (つまり、荷電されていない) ときに E255 が再評価されると、E255 のプロトン化確率は論理的に減少しますが、強く上方にシフトしたままになります。 対照的に、表面残基 E233 について計算されたプロトン化傾向は、E72 および E255 がプロトン化されていると仮定されるかどうかに関係なく、溶液中の遊離グルタミン酸の傾向と非常に類似しています。 この結果は、機能していないサイトで予想されるものであり、相対プロトン化エネルギーを評価するためにここで使用されたシミュレーション方法論の妥当性を裏付けています。

a プロトン化 YfkE (シアン) と Ca2+ 結合 VCX1 (オレンジ) の構造の比較。転座経路における 3 つの滴定可能な残基 (スティック) の構造変化 (黒い矢印) を示しています。 TM 2 と 7 は漫画として描かれています。 VCX1 では、E106 は H 結合 (黒い破線) によって水 (赤い球) を介して Ca2+ (緑色の球) と相互作用します。 VCX1 の残基には下線が付けられています。 b インサイドアウト小胞を使用して測定された 45Ca2+ 輸送動態分析は、WT とは対照的に E72Q および E255Q の活性を示さない。 データを(-)対照小胞で差し引いた。 エラーバーは標準偏差を表します (n = 3)。 c〜e YfkE WT（c）、E255Q（d）、およびE72Q（e）のタンパク質溶液へのCa2+の等温滴定曲線。 データフィッティングはソフトウェアOriginを使用して実行されました。

E72およびE255に関する我々の発見とは対照的に、同じアプローチを使用したH256の検査は、この側鎖が結晶構造によって捕捉されたYfkEの立体構造において脱プロトン化されていることを示している(表2)。 E72 と E255 が負に帯電していると想定される場合でも、原理的には H256 での正電荷が有利になりますが、溶液中のヒスチジン類似体と比較したり、曝露された H226 と比較したりして、H256 のプロトン化確率に有意な変化は検出されません。タンパク質の表面にあります。 E72 と E255 がプロトン化されていると仮定すると、H256 がプロトン化される可能性はさらに低くなります。 実際、脱プロトン化された H256 は明らかに有利です (つまり、その「見かけの pKa」は下方シフトします)。

結論として、この分析は、YfkE の内向き結晶構造が基質結合状態、つまり部位 E72 および E255 に結合した 2 つの H+ を捕らえていることを示しています。 しかし、H256 は 3 番目の H+ には同時に結合せず、YfkE のアンチポート化学量論が 1Ca2+:2H+ である可能性があることを示唆しています。 これらの結果は、E72 または E255 のいずれかのアラニン変異が実験アッセイにおける H+ 駆動の Ca2+ 輸送を無効にするという上記の観察と一致しています 12。 対照的に、H256 のアラニン変異の影響は、重大ではあるものの、N69A や Q281A12 など、H+ 結合部位付近にある他のプロトン化不可能な極性側鎖の変異の影響に匹敵します。

前述したように、酵母由来の CAX タンパク質 VCX1 の構造研究により、結合した Ca2+ イオンが検出されたと報告されています 11。 結合部位は 2 つの酸性残基 E109 と E305 によって形成され、それぞれ YfkE の E72 と E255 に相当します。 したがって、この部位への結合に関して 2 つの H+ が 1 つの Ca2+ と競合することは明らかであると思われます。 しかし、E72 と E255 の異なるプロトン化傾向は、この競合メカニズムにおいてそれらが似ていないことを示唆しています。 実際、VCX1 の構造は、Ca2+ 結合におけるこれら 2 つのカルボン酸残基の異なる役割も示しています。つまり、E305 (YfkE の E255) は Ca2+ に直接配位しますが、E109 (YfkE の E72) は 3 つの水分子を介してイオンと間接的に相互作用します (図5a)11． Ca2+/H+結合におけるそれらの特定の役割についての洞察を得るために、我々はE72とE255をグルタミンに変異させました。これにより、Ca2+結合は原理的に可能のままでありながら、脱プロトン化が排除されます。 予想どおり、アンチポートサイクルを閉じるには両方のカルボン酸側鎖の脱プロトン化が必要であるため、E72QまたはE255Q変異のいずれかはCa2+輸送を完全に廃止しました（図5b）。 しかし、ITC を使用したこれら 2 つの変異タンパク質の検査により、これらが H+/Ca2+ 結合に関して異なる役割を持っていることが確認されました。 WT YfkE に対する Ca2+ 滴定により、0.46 ± 0.02 μM の結合親和性が得られました (図 5c)。 滴定範囲内ではE255Qの飽和は観察されず、E255カルボキシレート基がCa2+結合に必要であることを示しています（図5d）。 顕著な対照的に、E72Q は Ca2+ 結合を損なわないため、E72 のカルボキシレートは不要であると思われます。 代わりに、この変異により、WTと比較して見かけのCa2+結合親和性が3倍（Kd = 0.14±0.001μM）増加します（図5e）。 計算結果と実験結果を総合すると、YfkE が内向き状態の Ca2+ を認識するメカニズムの最初のステップは E255 の脱プロトン化であることが示唆されます。 このステップは Ca2+ 結合に必要かつ十分です。 E72 の脱プロトン化はその後に起こり、その後、外向きの状態への大規模な立体配座転移が続く可能性があります。

複数の証拠が、Ca2+ と Pi の両方が中央転座経路で隣接して結合していることを支持している。まず、Ca2+ 結合に関与する残基、すなわち E72 と E255 の変異は、Pi 輸送（図 3a）だけでなく、Pi 結合も無効にする（図 3a）。図３ｅ）； 第二に、LRET で測定したように、Ca2+ と Pi は同様の構造変化を誘導します (図 4)。 第三に、Pi の共輸送は Ca2+ の KM を変化させます (図 1b)。 YfkE の構造では、N69、N99、Q252、Q281、および H256 を含むいくつかの極性残基が、輸送結合部位の近くの E72 および E255 に隣接して位置しています 12。 これらの極性残基はCAXファミリーで保存されていますが（補足図7）、VCX111のCa 2+ 結合状態構造ではCa 2+ と直接相互作用しません。 我々は、これらの残基がPi結合に関与していると仮説を立てます。 この仮説を検証するために、Pi輸送アッセイを使用してこれらの極性残基のアラニン変異の影響を調べました（図6a）。 Pi結合における各残基の役割は、輸送KM分析によって評価されました(表1)。 KM の最も顕著な変化は Q281A および H256A で見られ、WT と比較して 6 ～ 7 倍の減少を示し、Pi 認識における重要な役割を示しています。 Ca2+とPiの結合部位が近接しているという我々の仮説と一致して、これらの変異はCa2+の取り込みも妨害することに留意すべきである12。

インサイドアウト小胞を使用して測定された Pi 輸送動態アッセイ: N69A、N99A、N252A、Q281A、および H256A。 動態解析に有用なデータを得るために、変異体に対して異なる濃度 (WT の 5 倍) の小胞が使用されました。 データを(-)コントロール小胞で差し引いた後、GraphPad 9を使用してMichalis-Menten反応速度論に当てはめました。エラーバーは標準偏差を表します(n = 3)。 b 膜面に沿って見た YfkE モデルの概要。 それぞれ 5 つの膜貫通ヘリックスを含む 2 つの逆トポロジー リピートがオレンジ色 (TM1 ～ TM5) とマリン ブルー (TM6 ～ 10) で色付けされています。 膜貫通ヘリックス (TM0) は N 末端リピートの前にあります。 Ca2+ (マゼンタの球) と Pi (黄色と赤の球) の結合部位は、いわゆるアルファリピート、つまり TM2-TM3 および TM7-TM8 の残基によって形成されます。 c YfkEのCa2+とPiの結合部位の仮説構造の拡大図。 イオン配位に関与する残基が強調表示されます。 提案された相互作用ネットワークは黒い線で示されます。 d c と同じですが、この研究で生成されたモデルのアンサンブルから計算された占有マップが重ねられています。 具体的には、この図は、タンパク質側鎖 (灰色のメッシュ)、Ca2+ (緑色のメッシュ)、および Pi (赤色のメッシュ) の両方について、85% 値での占有マップの等高線を示しています。 つまり、等高線の内側の構造部分はアンサンブルの 85% にわたってほぼ一貫していますが、外側の部分は変化します。

既存の構造の内側を向いた YfkE がアポ構造ではなく H+ 結合状態を表すことを確立したので、H+ 後に Ca2+ とモノアニオン性 Pi がどのように同時に認識され輸送されるかを説明する可能性があるこの構造の変化のモデル化を進めました。荷降ろされています。 そのために、我々は、この対向輸送体について得た生化学的および機能的データを反映する一連の幾何学的制約を満たす解決策のみを考慮するように適合された、従来の相同性モデリングに似た手順を使用した（詳細については「方法」を参照）。 このモデルには、タンパク質データバンクの調査から得られた情報、具体的には、Ca2+ と Pi を同時に認識する既知の構造のタンパク質、つまり PON116 として知られる Ca2+ 依存性加水分解酵素から得られた情報も組み込まれています。 このタンパク質は、Ca2+とPiが配位する中心部位を備えたドーナツ状の構造を示し、YfkEとVCX1の結合部位と著しく類似しているように見えます（補足図8）。

上記で列挙した一連の制約と互換性のあるサイドチェーン構成の範囲を適切に調査するために、合計 2000 のモデルのアンサンブルを生成しました。 次に、ペアごとの類似性に基づくクラスタリング アルゴリズムを使用して、この構造アンサンブルを分析しました (詳細については「方法」を参照)。 図 6b ～ 図 6d に示すモデルは、最も人口の多いクラスターを表しており、生成されたすべてのモデルの約 52% が含まれています。 設計により、このモデルは、H+ 結合状態の実験的構造と比較して、バックボーンの立体構造の偏差が最小限に抑えられています。 それにもかかわらず、化学的にもっともらしいだけでなく、既存の実験データとも整合性のあるモデルを作成するには、限られた数の側鎖の再配置で十分であることは明らかのようです。 具体的には、Ca2+ は、E72 および E255 のカルボキシレート基と、および G68 および N69 のカルボニルとの同時二座相互作用を介して配位されます。 Pi は近接しており、アクセプターとして機能する準備ができていると思われる H256 に加えて、水素供与体として機能する複数の残基によって配位されています。 この内向きモデルは定義上仮説ですが、生化学的および生理学的データにもっともらしい構造的背景を提供し、YfkE 内の共有部位での Ca+ と Pi の同時認識が完全に実現可能であることを示すと我々は仮定します。

細胞質の Ca2+ 濃度の変動は、普遍的な細胞シグナル伝達戦略です。 しかし、Ca2+ 媒介シグナル伝達は、濃度変化の大きさだけでなく、それらの変化の特定の速度、頻度、時空間パターンにも依存します。 刺激に応答してこれらの複雑なシグナルを生成するには、Ca2+ の流入と流出を制御するために、原形質膜および細胞内小器官の膜上の Ca2+ チャネル、トランスポーター、およびポンプの協調作用が必要です 9,17。 単細胞生物および高等植物では、CAX 対向輸送体は、この複雑な Ca2+ バランスを維持するための主要な機構の 1 つを提供します 3,18。

この研究では、CAX の制御機構の一種を明らかにします。 我々は、細菌の CAX ホモログ YfkE の H+/Ca2+ 交換活性が Pi の存在下で大幅に加速できることを発見しました。 さらに、大腸菌小胞（図2a）と再構成プロテオリプソーム（図2d）の両方を使用した結果は、YfkEがPiをCa2+と共輸送していることを強く示しています。 つまり、Pi は Ca2+ の流出を促進する「輸送の補助者」であると考えられるかもしれません。 私たちの輸送アッセイに基づくと、Ca2+とPiのカップリングは非常に特異的ですが（補足図1）、これら2つのイオンは異なる親和性を示します。つまり、Ca2+の見かけのKMは0.15 mM（図1b）であるのに対し、Piの見かけのKMは0.15 mMです（図1b）。は5 mMであり(図3c)、これはITC実験でも実証されています(図2f)。 この差異は、細胞内の濃度の違いを反映している可能性があります。 サイトゾル [Ca2+] は μM9,19 未満に厳密に制御されていますが、Pi は原核細胞と真核細胞の両方で 1 ～ 10 mM とはるかに豊富です 20,21。 サイトゾルPiの豊富さにより、YfkEは典型的な生理学的条件下でCa2+とPiを共輸送できるはずです。

Pi は細胞代謝における重要な成分であるだけでなく、シグナル伝達分子としても機能します22。 リン酸恒常性を促進するために、複数の Pi 輸送システムが利用可能です。 細菌および酵母では、特定の Pi 結合タンパク質が細胞膜での周囲の Pi 利用可能性の変化に応答し、細胞内シグナルを伝達して Pi の取り込みに関与する遺伝子の発現を上方制御します 23,24。 YfkE の Ca2+ 排出活性がサイトゾル Pi の利用可能性によって調節されているという我々の発見は、CAX タンパク質が細胞内の 2 つの必須イオンである Ca2+ と Pi の両方の恒常性に関与しているという仮説を提起します。 YfkE が枯草菌の胞子形成に関与していることが以前に示唆されました 25。 興味深いことに、逆行性バチルス胞子では、Ca2+ の蓄積がリン酸カルシウム塩として見出されました 26。 YfkE はその Ca/Pi 共輸送活性を利用してこのプロセスを調節している可能性があります。 これらすべての仮説にはさらなる調査が必要ですが、Ca2+-Pi の共輸送が細菌と植物の両方で報告されていることは注目に値します。 ローゼンら。 は、大腸菌における Ca2+ の流出が 2 つの輸送系、つまり Pi に依存しないものと Pi に依存するものという 2 つの輸送系によって媒介されることを発見しました 27。 シロイヌナズナでは、液胞 H+/Ca2+ トランスポーター CAX1 および CAX3 の破壊により、Pi 含有量に顕著な変化が引き起こされます 28。 私たちの生化学的、生物物理学的、およびコンピューターによる分析は、YfkE が、E72、E255、N69、N99、Q252、Q281、および H256 を含む多くの CAX タンパク質間で保存されている残基との直接的または間接的な相互作用を通じて、共通の部位で Ca2+ と Pi を認識することを示しています (補足図7)。 したがって、YfkE で観察された共輸送メカニズムは CAX ファミリー内で共通の特徴である可能性があると思われます。

YfkE および他の CAX タンパク質の輸送機構は交互アクセスモデルによって正確に記述される可能性が高いが、その確認には既存の内向き状態を超えたさらなる構造情報が必要となる。 我々の機能的および構造的分析により、サイトゾルPiの利用可能性によって活性化されるYfkEの制御機構が明らかになりました。 Piの不在または存在量が少ない場合、YfkEは、中央部位の2つのカルボン酸残基であるE72およびE255に対するイオン競合を伴う低流出H + / Ca 2 + 交換モードで機能します（図7a）。 E72 と E255 は両方とも機能的に必須です。 前述したように、我々の計算結果は、YfkE が E255 と E72 で輸送された H+ を運ぶことを示しています (表 2)。 私たちのITC実験（図5c〜e）は、内側を向いた状態への最初のCa2+結合にはE255で結合したH+の置換が必要ですが、必ずしもE72での置換ではないことを示唆しています（表2）。 ただし、トランスポーターが外向きの状態に戻る前に、両方のプロトンが解放されなければなりません。 したがって、Ca2+が部分的にプロトン化された形態に結合した後の中心部位の完全な脱プロトン化が、速度論的な観点からの制限因子である可能性がある。

YfkE は、Pi の非存在下でも低排出輸送モードを維持します。このモードでは、H+/Ca2+ の交互アクセスが内向き状態と外向き状態の間の構造遷移を引き起こします。 b サイトゾルPiの存在（または増加）は、YfkEを高フラックスH + / Ca-Pi共輸送モードに促進します。 どちらのモードでも、E72 は H+ (緑色の球) を E255 に移動して、Ca2+ (青色の球) を解離します。 共輸送モードでは、Ca2+ に隣接する E255 と H256 の間に結合した Pi (赤い球) が輸送ターンオーバーを促進します。

サイトゾル[Pi]の上昇は、Ca2+流出をPiの共輸送に結合させることによりトランスポーターを高フラックスモードに切り替え、ドッキングモデルが示唆するように、両方のイオンが経路の中央部位で隣接して認識されます（図7b）。および突然変異の研究（図6）。 Pi が Ca2+ 流出を促進するメカニズムについては、さらなる研究が必要です。 サイトゾルの Pi が十分に豊富な場合、Pi は H+/Ca2+ 交換反応の熱力学を変化させる可能性があり、この反応は内向きの H+ 勾配に加えて Pi の外向きの膜貫通勾配によって活性化されます。 あるいは、またはさらに、Ca2+ に加えて Pi が結合すると、トランスポーターからの H+ の完全なアンロードが加速され、それによって Ca2+ に結合したまま内向き状態と外向き状態の間で遷移できるようになる可能性があります。 この仮説は、Pi の結合により輸送された Ca2+ の Vmax が 8 倍と大幅に増加する一方で、輸送された Ca2+ (KM) の結合親和性はわずかに減少するという速度論的分析によって裏付けられています。 私たちの仮説構造モデルによれば、結合したPiはE72と直接相互作用しませんが、E255に近接しています（図6c、d）。 したがって、E72からのH+の放出はE255を介して起こり、モノアニオン性PiがE255とH256の間の一時的なプロトン化部位として機能し、その後H+をサイトゾルに降ろす可能性がある。 したがって、Pi は、内向き状態からの完全な H+ 解離を促進することにより、輸送ターンオーバーを加速すると考えられます。 注目すべきことに、Pi輸送のVmaxはpH 7.5でピークに達し、これはモノアニオン性H2PO41-種とジアニオン性HPO42-種の間の平衡のpKa（7.2）に非常に近い（図3g）。 興味深いことに、Pi 媒介 H+ 移動機構 (2 つのカルボン酸残基間) も H+/リン酸トランスポーターについて提案されています 29。 したがって、この種の H+ ホッピング機構は Pi 結合トランスポーターに共通していると考えられます。 CAX11、12、13 の複数の構造が利用可能であるにもかかわらず、H+ 対 Ca2+ の化学量論は、その決定が依然として技術的に困難であるため、とらえどころがありません。 この研究では、CAX ホモログの輸送活性が、それ自体がプロトン化可能な種である Pi の存在によって調節されていることを発見しました。 したがって、この交換メカニズムにおける Pi、Ca2+、および H+ の間の相互作用を詳しく分析するには、各輸送モードでの H+ カップリングを注意深く特徴付ける必要があります。

YfkE は CaCA スーパーファミリーに属しており、これまでのところ生命のすべての領域に 200 以上のメンバーが含まれています 18。 すべての CaCA ホモログは、α-リピートとして知られる 2 つの配列モチーフ (TM2-3 および TM7-8) を特徴とし、H+/Na+/Ca2+ 配位に使用される 2 つのカルボキシレート残基 (例、YfkE の E72 および E255) を特徴とします。 ただし、これらのモチーフは厳密には保存されておらず、その配列の変化はさまざまなトランスポーターの基質選択性を調節し、最終的には交換サイクルのカップリングイオンがH +であるかNa + 11、12、13、30であるかを決定すると考えられます（補足図9）。 。 YfkE では、外向きの状態にある E72 と E255 の両方がプロトン化されると、トランスポーターが内向きの立体構造に到達し、細胞質の Ca2+ (および Pi) をロードできるようになります。 Na+/Ca2+ 交換体 NCX_Mj の 2 つの対応するカルボン酸残基である E54 および E213 も、外側を向いた状態で H+ に結合できますが、トランスポーターは内側を向いた状態にアクセスできないため阻害されます 31,32。 NCX_Mj が H+ 30,33 を輸送しないという事実。 対照的に、Na+ 結合はその構造転移を促進し、NCX_Mj が内向きの Na+ 勾配を利用できるようにします。 したがって、トランスポートとバインディング仕様の間の対応は自明ではなく、完全な交互アクセス サイクルのエネルギー特性のマッピングが必要です。 さらに、配列の変化により、より複雑なイオン依存性も生じます。 たとえば、脳細胞では、NCKX は Na+ と引き換えに K+ と Ca2+ の共輸送を触媒します。 この K+ 依存性は、2 番目の α-リピート内の単一のアスパラギン酸残基に起因すると考えられています 34。 ミトコンドリアでは、Na+/Ca2+ 交換体 NCLX は Ca2+ と交換して Li+ を輸送することもでき、この輸送モードは 2 番目のリピートの単一アミノ酸置換に依存します 35。 我々の結果は、多くのCAXタンパク質間で（そして2番目のリピートでも）保存されているが、Na + / Ca2+交換体のロイシン/スレオニンに置き換えられているH256（補足図9）が、細胞内でのCa2+-Piの共輸送を可能にする必須の残基であることを示唆しています。 YfkE。 このヒスチジンは、一部の原核生物のCAX、たとえば大腸菌由来のCAXホモログであるChaAには存在せず、グリシン残基が同等の位置に見られます（補足図9）。 しかし、ChaA は、H+ 結合 K+ または Na+ の流出を媒介するという点で YfkE とは異なります 36,37。 したがって、Ca2+/Pi 共輸送活性が他の CAX ホモログにも存在する可能性があると考えられます。 いずれにせよ、我々の発見は、CaCAタンパク質がCa2+認識に使用されるα-リピートモチーフを微調整することによって基質選択性を変化させ、その結果、異なる細胞型で異なる活性化または制御機構をもたらすというさらなる証拠を提供する。

インサイドアウトベシクル（ISO）は、低圧均質化法によって調製されました。 簡単に説明すると、pET28a-YfkEベクターを保有する大腸菌BL21(DE3)細胞を、ルリアブロス培地中で37℃でA600が0.4になるまで増殖させた。 突然変異は、標準的な部位特異的突然変異誘発アプローチを使用して生成され、配列決定によって確認されました。 タンパク質発現は、0.2 mM イソプロピル β-d-1-チオガラクトピラノシド (IPTG) を 25 °C で 2 時間添加することによって誘導されました。 細胞を、10 mM Tris-HCl pH 7.3、140 mM KCl、0.5 mM DTT、250 mM スクロースを含む緩衝液で洗浄した。 細胞の破裂は、低圧 (4000 psi) で C3 ホモジナイザー (Avestin) を 1 回通過させることによって処理されました。 遠心分離により細胞破片を除去した後、上清をTi45ローターを使用して40,000 rpmで1時間遠心分離し、膜小胞をペレット化した。 小胞を同じ緩衝液中でホモジナイズし、使用前に液体窒素中で急速凍結させた。

YfkE の Ca2+ 輸送活性と Pi 輸送活性の両方を、インサイドアウト小胞を使用して測定しました。 簡単に言うと、膜小胞を同じ成分を含む緩衝液（pH 8.0）で希釈しました。 アッセイの前に、5 mM NADH を小胞に 10 分間添加することにより、外向き H+ 勾配を確立しました。 サンプル中には少数の右向き小胞が存在する可能性がありますが、NADH は膜不透過性であるため、これらの小胞内の電子伝達鎖を活性化することはできません。 したがって、測定される唯一の活性は、インサイドアウト小胞の活性です。 Ca2+輸送活性を測定するために、5mMの冷リン酸カリウムも小胞に添加した。 リン酸輸送活性を測定するために、代わりに 0.5 mM 冷 CaCl2 を添加しました。 室温での反応に示されているように、輸送アッセイは 45Ca2+ または 32P-Pi (Perkin Elmer) を添加することによって引き起こされました。 ミリポア濾過マニホールドでニトロセルロース膜 (0.22 μm) を通す濾過によって反応を停止させ、すぐに緩衝液で洗浄しました。 フィルターを風乾し、液体シンチレーションカウンターで計数して輸送活性を測定した。 ソフトウェアGraphpad Prism 9を使用して、ミカエリス・メンテン単一指数関数モデルにデータをフィッティングすることにより、速度論的分析を実行しました。小胞アッセイでは、空のベクターを保持するBL21(DE3)細胞で調製した膜小胞を対照として使用しました。 変異体の動態アッセイでは、モデルのフィッティングに有用なデータを得るために小胞の濃度を個別に調整しました。

YfkE WT および変異体のタンパク質は、同じアプローチを使用して発現および精製されました。 簡単に説明すると、タンパク質発現は、大腸菌 C41(DE3) 株において、自動誘導培地 38 中で 25 °C で一晩実行されました。 細胞を、20 mM リン酸ナトリウム、pH 7.4、500 mM NaCl、および 20 mM イミダゾールを含む緩衝液に懸濁し、その後 15,000 psi で C3 ホモジナイザー (Avestin) に 3 回通して破砕しました。膜画分を上記のように収集し、溶解液に懸濁しました。バッファ。 1% (w/v) n-ドデシル-β-マルトシド (DDM) を 4 °C で 1 時間添加して膜画分を可溶化し、Ni-NTA 樹脂 (GE Healthcare) とともにインキュベートしました。 樹脂を６０ｍＭのイミダゾールおよび０．０５％のＤＤＭを補充した緩衝液で洗浄し、次いで４００ｍＭのイミダゾールおよび０．０５％のＤＤＭを補充した緩衝液で溶出した。 溶出したタンパク質を、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、５００ｍＭ ＮａＣｌおよび０．０５％ ＤＤＭを含む緩衝液中で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ－２００ １０／３００ ＧＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してさらに精製した。

プロテオリポソームは、大腸菌総脂質（Avantipolar lipids Inc.）を使用して次のように調製しました。クロロホルムに可溶化した脂質を最初に不活性ガス下で乾燥させてガラス管内に薄い脂質フィルムを形成し、さらに真空下で一晩保持して残留クロロホルムを除去しました。 次いで、脂質フィルムを２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１００ｍＭ ＮａＣｌ中に再懸濁し、懸濁液が透明になるまで氷上で超音波処理した。 2 回の凍結融解サイクルの後、ミニ押出機 (Avanti Polar Lipids Inc) を使用して、生成された大きな多重層小胞を 400 nm のポリカーボネートフィルターに 11 回通過させ、単層リポソームを形成しました。 再構成する前に、脂質 1 mg あたり 5 μl の 10% Triton X-100 (wt/vol) を室温で 30 分間加えることにより、リポソームをまず不安定化しました。 YfkEタンパク質を界面活性剤で不安定化したリポソームと1:10(w:w)の比で氷上で20分間混合した。 混合物にバイオビーズを加えて界面活性剤を除去し（サンプル 1 ml に対してビーズ 80 mg）、穏やかに撹拌しながら 4 °C で一晩プロテオリポソームを形成しました。 翌日、新鮮なバイオビーズをさらに 3 時間加えて再構成を完了しました。

Pi輸送活性を測定するために、200μlの4mg/ml YfkE再構成プロテオリポソーム（pH = 7.4）を、20 mM HEPES（pH = 8.0）、100 mM NaCl、5 mM 32P-リン酸（Perkin Elmer）を含む400μlの緩衝液に希釈しました。 、および０．５ｍＭ ＣａＣｌ２（または対照として２ｍＭ ＥＤＴＡ）を室温で加えた。 示された時間で、ミリポア濾過マニホールド上のニトロセルロース膜 (0.22 μm) を通して濾過することによって反応を停止させ、その後すぐに緩衝液で洗浄した。 次いでフィルターを風乾し、液体シンチレーションカウンターで計数して輸送活性を測定した。

アッセイの前に、10 μg の精製 His-tag YfkE タンパク質を 100 μl の Ni-NTA ビーズと混合しました。 ４０ｍＭの３２Ｐｉを、０．５ｍＭのＣａ２＋の存在下でビーズに１０分間添加した。 次いで、Piを含まないタンパク質緩衝液を使用してビーズを徹底的に洗浄した。 250 mM イミダゾールを使用してタンパク質を溶出し、シンチレーションカウンターを使用して放射能を測定しました。

天然の膜環境におけるタンパク質の立体構造変化は、ISO の LRET を使用して検出されました。 特異的な標識を確実にするために、部位特異的突然変異誘発を使用して 2 つの内因性システイン残基 (C34 および C293) をバリンに置換し、システインを含まない YfkE 構築物を生成しました。 次に、蛍光標識のために一対のシステイン残基を導入しました。1 つのシステイン残基 C3 は N 末端に挿入され、もう 1 つのシステイン残基は YfkE 構造に基づいて 56 または 202 の位置に配置されました。 C3 の直後のアミノ末端隣接配列には、最適な LRET シグナルを得るためにドナーとレセプターの間の距離を広げるための His6 タグと、バックグラウンドを正規化するためのトロンビン切断部位が含まれています。

ISO は、上記のアプローチを使用して作成されました。 小胞標識は、ドナーおよびアクセプター蛍光団の 200 nM マレイミド誘導体を使用し、暗所、室温で 1 時間、チオール反応性化学を使用して実行されました。 使用される蛍光体は、テルビウムキレート (Invitrogen) および Atto-465 (Sigma) です。 標識後、小胞を10 mM HEPES pH 7.3、140 mM KCl、および250 mM スクロースを含む緩衝液に対して4℃で2時間2回透析し、過剰なプローブを除去しました。 蛍光スキャンの前に、0.5 mM CaCl2 および/または 5 mM リン酸カリウム (pH 7.3) を小胞と混合しました。

蛍光測定は、キュベットベースの蛍光寿命分光計 QuantaMaster モデル QM3-SS (Photon Technology International) を使用して実行されました。 各実験は、特定の状態に対する 3 つの測定値の平均として報告され、各測定値にはフラッシュ ランプからの平均 99 パルスが含まれます。 データは、Fluorescan ソフトウェア (Photon Technology International) を使用して収集し、Origin ソフトウェア (OriginLab Corp) を使用して分析しました。 アクセプターの増感された発光は、バックグラウンド蛍光を差し引くために使用される確立された技術であるトロンビン切断の前後で検出されました 39,40,41。 具体的には、アクセプター寿命測定値を得た後、5単位のウシトロンビン(Calbiochem)をキュベットに添加し、N末端標識蛍光団を切断させた。 切断はトロンビンの添加後 1 ～ 3 時間で完了しました。 ドナーアクセプター標識サンプルは 337 nm で励起され、発光は 508 nm で検出されました。 距離はフェルスター方程式 (式 (1)) を使用して計算されました。

Ca2+ および Pi 結合親和性は、等温滴定熱量測定 (ITC) を使用して測定しました。 10 mM EGTA を添加することでタンパク質を脱灰し、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して分離しました。 Ca2+ または Pi 溶液は同じ緩衝液で調製されました。 ＩＴＣアッセイは、ＶＰ−ＩＴＣ装置（Ｍｉｃｒｏｃａｌ ＬＬＣ）上で５μＭまたは１０μＭのＹｆｋＥタンパク質の溶液中にＣａ２＋を滴定することによって実施した。 すべてのアッセイは同じ ITC プログラムを使用しました。システムは 25 °C で熱的に平衡化されました。 １２０秒の最初の遅延の後、３０７ｒｐｍの撹拌速度で２４０秒の間隔を置いて連続注入（各１０μｌ）を行った。 各測定値は、リガンドを緩衝液中で滴定するバックグラウンド滴定で補正しました。 データフィッティングは、Origin ソフトウェア (Microcal LLC) を使用して実行されました。

シミュレーションは、内向き YfkE (PDB 4KJR)12 の結晶構造に基づいています。 すべてのシミュレーションは、タンパク質と脂質の CHARMM36 力場を使用して NAMD 2.942 で実行されました 43,44。 すべてのシミュレーションは、周期境界条件と 2 fs の積分時間ステップを使用して、一定温度 (298 K) および半等方性圧力 (1 atm) で実行されました。 長距離静電相互作用は、実空間カットオフ 12 Å で PME を使用して計算されました。 ファンデルワールス相互作用は、レナード・ジョーンズポテンシャル、12Åでカットオフ、10Åで有効となる滑らかなスイッチング関数を使用して計算されました。 研究された特定のタンパク質構築物は、残基 1 ～ 177 (TM-TM5) および残基 200 ～ 351 (TM6 ～ TM10) を含む単一プロトマーです。 TM5 と TM6 を接続する一見構造化されていないように見える細胞質ループが切断されていました。 タンパク質構築物は、GRIFFIN45 を使用して、事前に平衡化された水和パルミトイル-オレオイル-ホスファチジル-コリン (POPC) 脂質二重層に埋め込まれ、サイズ約 88 × 88 × 95 Å の斜方晶系ボッ​​クスに封入されました。 結果として得られるシミュレーション システムには、207 個の脂質分子と 100 mM KCl バッファーを含む約 76,700 個の原子が含まれています (補足図 6)。 シミュレーション システムは、タンパク質構造に作用する位置的および構造的拘束が 100 ns かけて徐々に弱められる一連の MD 軌跡を含む段階的プロトコルに従って平衡化されました。 タンパク質の特定の側鎖のプロトン化状態を既知の pKa の基準と比較して評価するために、同じタイプのアミノ酸が溶液中に含まれていないシミュレーション システムに含まれています。 このアミノ酸は、側鎖のプロトン化エネルギーを分離するために、N 末端がアセチル修飾で中和され、C 末端が二級アミドで中和されています。 シミュレーション全体を通じて、遊離アミノ酸は溶液中に維持され、特定のしきい値距離で作用する一連の反発ポテンシャルによって他のすべての溶質 (タンパク質、膜、イオン) から遠ざけられました。 タンパク質側鎖と溶液中の同等物の両方に二重トポロジー (プロトン化および脱プロトン化) が導入されました。 次に、自由エネルギー摂動 (FEP) アルゴリズムを使用して、両方の側鎖のプロトン化状態を同時に、しかし反対方向に変更しました。 したがって、得られる自由エネルギー値は、溶液中のその側鎖タイプに固有のものに対するタンパク質側鎖のプロトン化傾向の増加または減少を反映します（補足図6）。 この変換は両方向、つまりタンパク質側鎖のプロトン化と遊離アミノ酸の脱プロトン化、またはその逆で行われました。 表 2 に示す ΔΔG 値は、これら 2 つの計算の平均値を反映しています。 半差はエラーバーとして表示されます。 各計算は一連の連続した MD シミュレーションで構成され、一方のトポロジーが徐々に他方のトポロジーに置き換えられるとパラメーター l が 0 から 1 (またはその逆) に変化し、対応する位置エネルギーの変化が各シミュレーション スナップショットに注釈付けされます。 各変換は 40 ステップで離散化され、各ステップはタンパク質内部の側鎖の場合は 1 ns、より可動性の高い表面の側鎖の場合は 240 ps のシミュレーションで構成されました。 これら 40 のシミュレーションは順番に実行されました。 l を段階的に変化させるたびに、軌道の断片 (それぞれ 200 または 40 ps) が平衡時間とみなされ、自由エネルギーの計算から除外されました。

我々は、以下の基準を満たすタンパク質 X 線構造を分析しました。(i) 分解能が 3.0 Å 以上である。 (ii) 以前に選択された構造との配列同一性が 70% 未満である。 (iii)構造は、共通の結合部位に結合した1つのカルシウムイオンと1つのリン酸イオンを有する(すなわち、2つのイオン間の最小距離は3.2Å以下である)。 (iv) YfkE のように、結合部位には 2 つの酸性側鎖と 1 つのヒスチジン側鎖が隣接しています。 この調査により、1 つの構造、すなわちカルシウム依存性加水分解酵素 (PDB エントリー 3SRE) である哺乳動物血清パラオキソナーゼ 1 (PON1) の構造が明らかになりました 46。

Ca2+ とリン酸に結合した YfkE の分子モデルは MODELLER v9.1347 で生成されました。 従った手順は、ここでのターゲットが Ca2+/リン酸結合状態の未知の構造であり、テンプレートが既知の構造 (PDB 4KJR) であったことを除いて、相同性モデリングで使用された手順に似ていました 12。 結合部位に隣接する 4 つの TM ヘリックス (いわゆる α-リピート、つまり残基 59 ～ 110 および 239 ～ 296) の構造のみが改造されました。 Ca2+とリン酸が結合した結合部位の幾何学的形状を具体的にモデル化するために、前述のPON1とNCX_Mj16,30の構造、およびYfkEの野生型および変異型のCa2+/リン酸輸送研究から推測される一連の幾何学的拘束を追加しました。 。 具体的には、後者は、G68A、N69A、N99A、N252A、H256A、および Q281A の変異が、輸送を無効にすることなく、測定された KM および/または Vmax 値に重大な変化を引き起こすことを示しています。 したがって、2.6 Å 以上の距離 (および「偏差」0.1 Å) で作用する調和ポテンシャルを使用して、Ca2+ とタンパク質の間の以下の距離に制約が適用されました: (1) 4 つの酸素原子のそれぞれに対してE72およびE255のカルボキシレート基から; (2) リン酸塩の酸素原子に最も近いもの (H2PO4- としてモデル化)。 (3) G68 のカルボニルへ。 (4) N69 側鎖のカルボニル酸素。 まとめると、これら 4 つの制約は、Ca2+ 配位数 7 を意味します。同様の制約が、リン原子と (5) H256 の Nδ 3.9 Å、(6) N252 の Cγ (4.5 Å)、および (7) との間の距離に適用されました。 ）S278のCγ（4.5Å）。 (8) Q281 の Oε と N69 の Nδ (3.2 Å) の間の距離。 (9) N252 の Cγ と N99 の Cγ (4.2 Å) の間の値。 最後に、Ca2+ と E72 および E255 の間に二重二座相互作用を課すために、(10) Ca2+ と E72 および E255 の原子 Cδ、Oε1、および Oε2 によって形成される二面角 (0°、〜付き) にも制約が適用されました。 20°の偏差）。 合計 2000 のモデルのアンサンブルを生成し、ペアワイズ RMSD に基づくクラスタリングを通じてこのアンサンブルを分析しました。 この RMSD 計算には、残基 N69、E72、N99、N252、E255、H256、S278、および Q281 のすべての非水素原子と、Ca2+ およびリン酸イオンが含まれ、クラスターは 0.6 Å の RMSD 閾値によって定義されました。 この分析の結果、10 を超えるモデルで構成される 15 のクラスターが得られ、合計するとモデルの 92% に達します。

データの再現性を確保するために、すべての実験は少なくとも 3 回 (n = 3) 実行されました。 すべてのデータ ポイントとエラーバー (標準偏差) は、各図と補足データ (該当する場合) に示されています。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

この研究中に生成または分析されたすべてのデータは、この公開された論文 (およびその補足情報ファイル) に含まれています。 数値の出典データは補足データ 1 にあります。

MD シミュレーション用のファイルは、https://github.com/Faraldo-Gomez-Lab-at-NIH/Download で入手できます。

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この研究の初期段階については Mousheng Wu に感謝します。 この研究は、国立衛生研究所 (NIH) の助成金 R01GM143418 および LZJDF-G に対する米国心臓協会の助成金 18TPA34230046 によって支援されました。 は、NIH 国立心肺血液研究所の学内研究部門によって資金提供されています。 計算リソースの一部は、NIH 科学計算施設 Biowulf によって提供されました。

テキサス大学ヒューストン・マクガバン医科大学健康科学センター、膜生物学センター、生化学および分子生物学部、米国テキサス州ヒューストン

Wei Niu、Shuo Lu、Trung Vu、Vasanthi Jayaraman、Lei Zheng

米国国立衛生研究所、国立心肺血液研究所、理論分子生物物理学研究室、ベセスダ、メリーランド州、米国

周文昌 & ホセ・D・ファラルド＝ゴメス

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概念化: JDF-G。 そしてLZ。 分析: WN、WZ、SL、TV、VJ、JDF-G.、LZ。 調査：WN、SL、WZ、TV、VJ。 執筆—原案作成：JDF-G。 そしてLZ。 執筆 - レビューおよび編集: すべての著者。 監修：JDF-G そしてLZ。 プロジェクト管理: JDF-G。 そしてLZ。 資金調達：JDF-G。 LZ およびすべての著者は原稿を読んで同意しました。

ホセ・D・ファラルド＝ゴメスまたはレイ・ジェンへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Communications Biology は、この研究の査読に貢献してくれた匿名の査読者に感謝します。 主な編集者: Janesh Kumar と Gene Chong。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Niu, W.、Zhou, W.、Lu, S. 他 Ca2+ の流出は、H+/Ca2+ 対向輸送体 YfkE における無機リン酸アニオンの共輸送によって促進されます。 Commun Biol 6、573 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s42003-023-04944-6

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受信日: 2022 年 5 月 19 日

受理日: 2023 年 5 月 15 日

公開日: 2023 年 5 月 29 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04944-6

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