βのパターンを特徴付ける新しい戦略 - ハルビン硫酸シリーズ株式会社

Scientific Reports volume 13、記事番号: 9177 (2023) この記事を引用

1 オルトメトリック

メトリクスの詳細

CDC によると、カルバペネム耐性アシネトバクターバウマニ (CRAb) は公衆衛生上の緊急の脅威です。この病原体には治療法の選択肢がほとんどなく、致死率が 50% を超える重度の院内感染を引き起こします。これまでの研究では CRAb のプロテオームが検討されてきましたが、薬物曝露によって発生する可能性のある β-ラクタマーゼ発現の動的変化に焦点を当てた分析は行われていませんでした。ここでは、さまざまなβ-ラクタム系抗生物質を使用した場合のCRAbで発生するβ-ラクタマーゼ発現の変動に関する最初のプロテオミクス研究を紹介します。簡単に説明すると、Ab (ATCC 19606) に対する薬剤耐性は、さまざまなクラスの β-ラクタム系抗生物質の投与によって誘導され、無細胞上清が単離、濃縮され、SDS-PAGE で分離され、トリプシンで消化され、標識によって同定されました。無料の LC-MS ベースの定量的プロテオミクス。 UniProt の Ab β-ラクタマーゼの 1789 配列データベースを使用して、13 個のタンパク質が同定および評価されました。その大部分はクラス C β-ラクタマーゼ (80% 以上) でした。重要なのは、異なる抗生物質は、同じクラスの抗生物質（ペニシリンとアモキシシリンなど）であっても、クラス C および D セリン-β-ラクタマーゼのさまざまなアイソフォームを含む非同等の反応を誘導し、その結果、独特のレジストームが生じることです。これらの結果は、β-ラクタマーゼ発現に強く依存する細菌における多剤耐性の問題を分析および研究する新しいアプローチへの扉を開きます。

好気性グラム陰性球菌であるアシネトバクターバウマニ (Ab) は、ESKAPE 病原体の 1 つであり、現在 CDC1 によって公衆衛生に対する緊急の脅威として分類されています。この分類は、カルバペネム耐性抗体 (CRAb) 感染症の重症度と高い死亡率 (場合によっては 50% 以上) によるものです 2、3、4、5、6、7、8。さらに、これらの感染は一般に院内感染であり、患者がすでにより敏感になっている集中治療室（ICU、場合によっては世界中の ICU 感染の最大 31% を占める）で頻繁に発生します 2,9,10,11,12。

これらの病原体と戦うための新しい治療戦略を開発するには、それらの耐性メカニズムをより深く理解する必要があります。通常、細菌は標的修飾、流入/排出制御、代謝変化、β-ラクタマーゼの発現による薬物不活性化を組み合わせて利用しますが、これらの複数の戦略の相対的な寄与は病原体によって異なります7,13。例えば、Ab および CRAb は修飾ペニシリン結合タンパク質 (PBP) を発現できますが、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌とは異なり、これは一般に耐性の主要なメカニズムとはみなされていません 14。特に CRAb に関しては、初期の研究では PBP の修飾と制御の相対的な重要性について反対の見解が示されており、より最近の研究では、カルバペネマーゼの産生が CRAb の最も重要な耐性方法である傾向があることが示唆されています 14、15、16。カルバペネマーゼは、簡単に言えば、他の β-ラクタム系抗生物質に加えてカルバペネムを加水分解できる β-ラクタマーゼです。これらの例は、クラス A および D のセリン β-ラクタマーゼとクラス B のメタロ-β-ラクタマーゼに見られ、クラス D の OXA 型セリン β-ラクタマーゼは CRAb17、18、19 で定期的に検出されます。以前の研究では、このようなさまざまな OXA 型 β-ラクタマーゼが CRAb19 に見られることも報告されています。しかし、単一株中のβ-ラクタマーゼのセット全体を選択的に特徴づけ、それらを耐性変異体と比較する試みに関しては限られた研究が行われてきた20、21、22、23。

したがって、これらの酵素のコレクションをカタログ化し、分析することは、β-ラクタマーゼ阻害剤とβ-ラクタム系抗生物質を組み合わせる新しい併用療法の開発において重要なステップとなる可能性があります。最近の報告では、β-ラクタマーゼ阻害剤の新しい組み合わせが XDR Ab 感染症患者の治療に成功していることさえ実証されました。しかし、阻害剤自体はすべてのクラスに対して効果があるわけではないため、将来のβ-ラクタマーゼの変異によって阻害剤が無効になる可能性があります24、25、26。この問題の難しさは、薬剤耐性菌がβ-ラクタマーゼ遺伝子の複数のコピーを保有する可能性があり、効率的な細胞増殖を維持するためにこれらの遺伝子を同時に発現させる必要がない(または少なくとも同程度に発現させる必要がない)という事実にあります。したがって、細菌はβ-ラクタマーゼの独自のコレクションを発現し、その結果、抗生物質クラス (β-ラクタムなど) だけでなく分子依存性の特定のレジストームが生じる可能性があります。さらに、これらのレジストームが以前の抗生物質曝露の「記憶」をどの程度保持しているのか、また新たな環境ストレス因子にどれだけ早く適応できるのかは不明である。

細菌の抗生物質耐性とそれに影響を与える要因を理解するために、多くの研究がさまざまな「オミクス」アプローチを利用して、発生する可能性のある遺伝的 (ゲノム)、転写 (トランスクリプトーム)、代謝 (メタボロミクス)、および翻訳 (プロテオミクス) の変化を特徴づけてきました。薬物投与の結果として細菌に感染。これらのオミックスの中で、プロテオミクスは、抗生物質の使用などの外部刺激に対する細菌の反応に関する最も直接的な情報を提供します。したがって、多くの最近の研究は、薬剤耐性臨床分離株および実験室で誘導された薬剤耐性を有する細菌のプロテオームプロファイルまたはプロテオームを報告している20、27、28、29、30。通常、プロテオーム全体が測定され、代謝、活性酸素種の管理、薬物標的、DNA/RNA 修飾などに関連するタンパク質を含む、さまざまな薬剤耐性菌における多数のタンパク質の差次的発現が示されます。抗生物質耐性の Ab 株では、研究者らは β-ラクタマーゼの発現が一般的に上方制御されていることを観察しました 20、27、31、32。しかし、少数の研究ではさまざまな抗生物質と Ab の総タンパク質発現との相関関係が観察されていますが、細菌に対する特定の抗生物質 (同じクラスまたは異なるクラス) への曝露とその特定の酵素反応についての系統的な研究は行われていません。このような研究を裏付けるように、最近の 2 つの報告では、薬剤耐性のあるグラム陰性感染症の危険因子として、過去の抗生物質の使用と β-ラクタマーゼ阻害剤への曝露が具体的に特定されました 5,33。これらの研究と報告を総合すると、遺伝子、タンパク質、薬物構造、およびそれらの特定の機能がすべて相互に関連して薬物耐性を発症していることが示唆されています。したがって、さまざまなβ-ラクタム系抗生物質間の構造の違いが、β-ラクタマーゼ発現パターンの変化という形でさまざまな細菌耐性応答に重要である可能性があるという仮説を立てることができます。

ここでは、さまざまなβ-ラクタム系抗生物質への曝露に応答したAb（ATCC 19606; Ab19606）のβ-ラクタマーゼ発現の標的LC-MSベースの定量的プロテオミクス研究を紹介します。これは、SDS-PAGE を使用して細菌増殖培地から無細胞上清を分離し、その後タンパク質混合物の LC-MS-MS 分析を行うことで達成されました。

抗生物質耐性に関する研究で対照株として広く使用されている Ab19606 の β-ラクタム耐性を判定および特徴付けるため、4 つの異なるクラスの β-ラクタム抗生物質 (10 μg/mL) を含む栄養ブロス培地で培養しました。 β-ラクタムの繰り返し曝露によって耐性が誘導されたことを確認するために、ミュラー・ヒントン（MH）寒天培地上でディスク拡散アッセイを実施しました（図1a）。 37℃で24時間インキュベートした後、コロニーの増殖が観察されました。野生型の薬剤感受性ATCC 19606と比較して、薬剤耐性株に対するすべての抗生物質の阻害領域が減少しました。セフタジジム（セファロスポリン）とピペラシリン（ペニシリン）はそれぞれ5mmと6mm減少し、イミペネムはそれぞれ5mm減少しました。（カルバペネム）とメロペネム（カルバペネム）は、それぞれ 7 mm と 5 mm 減少しました。これにより、Ab19606 が暴露された抗生物質に対して顕著な β-ラクタム耐性を生成する可能性があることが確認されました。

(a) ディスク拡散アッセイを野生型およびβ-ラクタム選択された Ab19606 株を介して実行し、抗生物質処理による耐性を確認しました。誘導抵抗は直径のサイズを測定することによって決定され、すべての抵抗は 3 回の繰り返しによって確認されました。 (b) プロテオミクスアプローチのためのβ-ラクタム系抗生物質の選択とサンプルの分離/調製の実験スキーム。

これらの生物で発生する耐性のメカニズムをさらに評価するために、Ab19606 を栄養ブロスで増殖させ、阻害濃度以下の濃度のさまざまなベータラクタムおよび非ベータラクタム抗生物質を含む寒天プレート上にプレーティングしました。コロニーを選択し、5μM濃度の対応する抗生物質を含む栄養ブロスの1リットルフラスコ中で増殖させた。培養物が定常期に達したら、細胞を遠心分離し、Ultra-15 遠心フィルターユニットを使用して上清を濃縮しました（図 1b）。

β-ラクタム選択された Ab19606 株からの β-ラクタマーゼ酵素の存在を確認するために、発色性セファロスポリンであるニトロセフィンを比色指標として使用しました 34,35。最初に、この無細胞上清を細胞溶解物と比較して、β-ラクタマーゼが存在することを確認しました（補足図S1）。一般に、グラム陽性菌のみがβ-ラクタマーゼを細胞外空間に排出すると考えられています36。しかし、いくつかの出版物は、Ab などのグラム陰性菌もそうすることができることを実証しています 37,38,39,40,41,42。これは、無細胞上清もニトロセフィンを加水分解する能力を実証した我々の実験によって定性的に裏付けられています。すべての濃縮された無細胞上清サンプルについて、ニトロセフィン濃度を0.01μMから75μMまで変化させることによって酵素活性を検出でき、生化学活性パラメーター（Km、kcatなど）を取得できます（表1、補足図S2）。精製したTEM-1 β-ラクタマーゼのサンプルを、ポジティブカイネティクスコントロールとして使用しました。見かけの Km および kcat の結果は、TEM-1 コントロールの速度論パラメーターと同等であり、kcat/Km43 の妥当な範囲を示しています。これらの結果は、β-ラクタマーゼ酵素が濃縮された無細胞上清中に存在するだけでなく、適切な濃度範囲内にあること、およびさらなる特性評価が進む可能性があることを示唆しています。

LC-MS の準備として、Ab19606 によって発現された β-ラクタマーゼを視覚化して分離するために、5 μM 抗生物質に 72 時間曝露した後の Ab19606 サンプルに由来する高濃度の上清サンプルの SDS ゲル分離を実行しました（図 2a）。精製されたクラスA β-ラクタマーゼ (TEM-1、29 kDa/系統 1) を陽性対照系統として使用しました。 SDS-PAGE 後、両方のクーマシーブルー染色後、d-ラクタマーゼタンパク質が容易に確認できました。 β-ラクタムに曝露されたさまざまな Ab19606 サンプル (サンプル 1 ～ 9) から収集された上清を含むいくつかのレーンは、β-ラクタマーゼの発現に対応する 27.5 ～ 42 kDa のサイズに対応する位置に明確なバンドを示しました。興味深いことに、バンドの強度は可変であり、分離されたタンパク質ゲルのバンドは、耐性を誘導するために使用された抗生物質に応じて異なるタンパク質パターンと発現レベルを示しました。

(a) 無細胞上清サンプルの SDS-PAGE およびクーマシーブルー染色。精製したTEM-1 β-ラクタマーゼを対照として使用しました。すべてのクラスのβ-ラクタマーゼタンパク質を含む可能性のあるゲルの領域 (赤い四角) を、さらなるプロテオミクス分析のために切り出しました。 (b) 抗生物質曝露後に発現したβ-ラクタマーゼの相対割合。 ADC と AmpC は C 型 β-ラクタマーゼです。 OXAはタイプDです。 TEMはタイプAです。 PBP は β-ラクタム系抗生物質の標的ですが、構造が似ており、分子量も似ています。

SDSゲル電気泳動を使用してタンパク質の分離に成功した後、β-ラクタマーゼタンパク質を含むゲルの切片（図2aの赤い領域）をプロテオミクス分析のために切り出しました。 LC-MS/MS ベースのプロテオミクス実験は、薬剤耐性コロニーによって発現される β-ラクタマーゼアイソフォームを同定するために、ラベルフリープロテオミクス法 (MaxLFQ) を使用して実行されました。より具体的には、サンプル調製はトリプシン消化によって実行され、消化されたサンプルは高分解能液体クロマトグラフィー質量分析法 (LC-MS/MS) によって分析されました。次に、同定されたペプチドは、Ab19606 β-ラクタマーゼ配列データベースを含む FASTA ファイルを使用して、Mascot、Proteome Discoverer、および MSFragger を通じて分析および評価されました。

すべてのサンプルにわたって、少なくとも 2 つの固有のペプチド配列を含む、さまざまな β-ラクタマーゼアイソフォームと一致するさまざまな配列が同定されました (表 2)。次に、サンプルの測定された合計強度に対して標識なしの強度を正規化することによって、これらのアイソフォームの相対的な存在量を比較しました。次に、より大きなクラスに属するさまざまなタンパク質がグループ化されました。たとえば、OXA-51 と OXA-66 は 1 つの OXA グループにまとめられます (図 2b)。プロテオミクス解析では、β-ラクタマーゼ以外のさまざまなタンパク質も同定されましたが、最も顕著なタンパク質の種類は、クラス C とクラス D の両方に属するアンピシリナーゼ C (AmpC)、アシネトバクター由来 AmpC (ADC)、およびオキサシリナーゼ (OXA) でした。酵素（図2b、補足図S3）。重要なことに、Ab19606 によるこれらの酵素の発現は、ATCC によってカタログ化されている blaAmpC 遺伝子と blaOXA 遺伝子の両方の存在と一致します。 44 興味深いことに、これら 3 種類の β-ラクタマーゼタンパク質の相対量は、使用する抗生物質に応じて大きく異なることが観察されました。 Ab19606 が暴露されました。このデータは、特にAb19606がMICを超える濃度の抗生物質に曝露された場合に、β-ラクタマーゼの発現が特定の抗生物質処理によって影響を受ける可能性があることを示唆しています。この概念は、これらの活性耐性プロファイルが同じクラスの抗生物質でも異なるという観察によってさらに裏付けられます。たとえば、ペニシリン G（penG）、アモキシシリン（amox）、およびピペラシリン（pipe）はすべてペニシリンクラスの β-ラクタム系抗生物質ですが、まったく異なる応答を生成します（図 2b、補足図 S3）。

過去半世紀にわたり、抗生物質のおかげで人類は病原体に対して優位に立つことができました。しかし、突然変異と自然選択は、速い世代時間と巨大な集団サイズと相まって、現在、病原体に決定的な利点を与えています45、46、47、48。優位性を取り戻すには、抗生物質の構造と機能の関係、そして病原体がどのように組織的に進化して抗生物質を破壊することができるのかをより深く理解し、新しい治療戦略を設計できるようにすることが重要です。

細菌は、現在使用されている多くの種類の抗菌剤に対する耐性を着実に獲得しています。 Ab などの一部の細菌は、高レベルの薬剤耐性を発現する傾向があるため、広範囲薬剤耐性 (XDR) および汎薬剤耐性として分類されます 6,46,49,50。したがって、我々が Ab19606 および β-ラクタム系抗生物質を選択したのは、感染が一度発生すると利用できる治療法がほとんどないため、CRAb が現在 CDC によって優先脅威と考えられているという事実に基づいたものでした 1,46,51。さらに、カルバペネム耐性は、MDR または XDR と考えられる株でよく見られます50、52、53。 Ab および CRAb は、多くの細菌と同様に、複数の耐性モードを備えていますが、β-ラクタマーゼの作用による β-ラクタムの不活性化が最も重要なメカニズムである可能性があると考える人もいます 54,55。 β-ラクタマーゼは数が多く、類似性が高く、細菌間で容易に伝達され、資源が限られた環境でより大きな活性を発揮するために容易に変異するため、これにはいくつかの課題があります。しかし、これらの同じ特徴は、耐性をもたらす抗生物質と細菌との非特異的または意図しない相互作用を特定する機会も提供する可能性があると考えています。

図2および補足図S3に示されている私たちの発見は、抗生物質への曝露の結果として発生する可能性のあるβ-ラクタマーゼ発現の変動を示しています。重要なことに、すべての抗生物質は、主に ADC を発現することが判明した野生型 Ab19606 の発現プロファイルとは大きく異なる発現プロファイルをもたらしました。固有の配列は各酵素を識別することができ、タンパク質発現の MaxLFQ 定量化に使用されました。さらに、配列を並べて比較することにより、ADC (A0A5C1K4D3) および AmpC (A0A009PJF4 ～ A0A8D6JWD9) 酵素が実際にユニークなアイソフォームであることを示します (図 3)。

同定された AmpC (A0A009PJF4 ～ A0A8D6JWD9) および ADC (A0A5C1K4D3) アイソフォームの多重配列比較。赤色は、残基が参照配列 (AmpC) と一致することを示します。この図は、Schrodinger パッケージであるプログラムプライムを使用して生成されました。

これらおよび他の同定されたタンパク質のカバレッジマップは、補足図S4に提供されています。興味深いことに、AmpCおよびADCを含むクラスC β-ラクタマーゼは、さまざまなAb19606サンプル間で非常に高い変動性を持っていましたが、β-ラクタムサブクラス依存性を示しているようです（補足図S5）。より具体的には、カルバペネム処理サンプル (特にメロペネムとイミペネム) は、大部分の ADC とともに最も多くの AmpC (A0A009KWD8) を発現しました。同様に、ペニシリン G、アモキシシリン、ピペラシリンなどのより一般的なペニシリン由来の β-ラクタムで処理したサンプルでは、一般に、AmpC (A0A0R4J6T7) の割合が大幅に増加しました。この違いは、クラス C β-ラクタマーゼがカルバペネムを切断できないのに対し、ペニシリンやセファロスポリンは容易に加水分解するためである可能性があります 14、17、57。これは、カルバペネムで処理された細菌がより大きなストレス下にあり、その結果、β-ラクタマーゼの発現が増加し、突然変異の程度が大きくなり、関連アイソフォームの存在が増加することを示唆しています。

明確な傾向は観察できませんが、これと同じ概念が OXA および PBP タンパク質の可変発現にも拡張されるようです。ただし、これらのクラス D β-ラクタマーゼは既知のカルバペネマーゼであり、CRAb17、19、52 の進化に関与しているため、OXA の可変発現は重要です。私たちのデータでは、すべてのカルバペネムクラスの β-ラクタムが OXA の発現を実際に誘導したようで、メロペネムとファロペネムが全サンプル中で最大の相対量をもたらしました。イミペネムが必ずしもこの傾向に従わなかった理由、またはペニシリン、アモキシシリン、およびピペラシリンがすべて異なるものの OXA 発現レベルが低い理由は不明です。

β-ラクタムのクラス間、さらには同じサブクラスの化合物間のこれらの初期の違いの観察は有望であり、これまでに報告されているよりも抗生物質の構造と耐性発現の間により複雑な関係があることを示唆しています。しかし、化合物の濃度は生体内で大きく変化し、分布、代謝、細菌数の影響を受けるため、これらの研究が生体内での耐性生成とどの程度相関しているのかは不明である。さらに、我々の研究では、多微生物集団が遺伝子導入により耐性に与える影響を考慮することができませんでした。

無細胞上清溶液中に存在するβ-ラクタマーゼを分析するラベルフリープロテオミクス法の使用により、Ab19606 が適用された各β-ラクタム系抗生物質に対して異なるβ-ラクタマーゼプロファイルを生成することが観察されました。これらの結果は、特定のβ-ラクタム、ひいてはその構造が同じ細菌に異なる影響を与える可能性があることを示唆しており、抗生物質の構造/機能と耐性の生成の間にはより複雑な関係が存在することを示唆しています。今後の研究では、この変動がクラス内に存在する可能性、ランダムではない可能性、濃度依存の傾向が特定される可能性があるかどうかが調査される予定です。このような関係がさらに解明されれば、細菌の耐性メカニズムについての理解が大幅に広がるだけでなく、β-抗生物質の阻害や回避を可能にする可能性のある次世代の抗生物質や併用療法を設計するための重要な新しいツールにつながる可能性もあります。ラクタマーゼベースの耐性。

Ab19606 を栄養ブロス中で 37 °C で一晩増殖させました。培養物を 0.5 マクファーランド標準 (1.5 × 108 CFU/mL) まで希釈し、100 μL を Mueller-Hinton 寒天上に広げました。 Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) に従って、適切な量の抗生物質を 6 mm ディスクに添加しました。阻害ゾーンを決定する前に、プレートを 37 °C で 18 時間インキュベートしました。その後の曝露のために、ディスクの阻害ゾーンに沿って細菌が収集され、栄養ブロス中で再培養されました。細胞は同様に調製されましたが、各ディスク拡散アッセイプレートには、細菌が収集された阻害ゾーンを作成するディスクからのものと一致する抗生物質ディスク（3×）のみが含まれていました。その後のアッセイは、耐性の発生を可能にする突然変異が現れるまで、通常は 2 ～ 3 継代で実施されました。

Ab19606 を栄養ブロス中で 37 °C で一晩増殖させ、0.5 マクファーランド標準 (1.5 × 108 CFU/mL) に希釈しました。 β-ラクタマーゼの発現を誘導するために、Ab19606 の培養物を、ストリーク法を使用してコロニーを単離するための阻害濃度以下の抗生物質を含む栄養寒天プレート上に広げ、37 °C で 24 時間インキュベートしました。次に、コロニーを選択し、選択に使用したものと同じ抗生物質 5 μM を含む栄養ブロス 1 L 中で 37 °C で 72 時間振盪しながら増殖させました。

前述の 1 リットル培養物を、培地中に存在する抗生物質によって誘導される β-ラクタマーゼ産生を分析するために使用しました。 72時間のインキュベーション後、培地を2回遠心分離しました(8000×g、10分間)。清澄化した上清を 0.2 μm シリンジフィルターで濾過し、残っている細菌性病原体を除去しました。次に、カットオフ 10 kDa の Millipore Sigma Ultra-15 遠心フィルターユニット (カタログ番号 UFC901008) を使用して、上清全体を濃縮しました。

TEM-1 を pET-TEM-1 ベクターを用いて大腸菌 BL21 (DE3) で発現させ、浸透圧ショックにより抽出し、Zn キレートクロマトグラフィーおよびゲル濾過 (セファクリル-100) により精製しました。 50 mM Tris、pH 8.0、および 150 mM NaCl を保存に使用しました。

上清中の精製 TEM-1 および β-ラクタマーゼの活性を、室温で 50 mM リン酸カリウム緩衝液 (pH 7.0) 中で分光測光法 (spectramax-M5-reader) で測定しました。これは、総量 100 μl 中のこれらの量での酵素の安定性に寄与します。レポーター基質としてニトロセフィン（ε486 nm = 20,500 M−1 cm−1）を用いた条件下でμl。ニトロセフィン (0.001 ～ 100 μM) を 50 mM カリウム緩衝液 (pH 7.0) で新たに調製しました。見かけの Km 値と kcat 値は、GraphPad Prism 9 のミカエリス・メンテン酵素反応速度論モデルと非線形回帰フィットを適用することにより、少なくとも 4 つの独立した初速度測定値から導出されました。

濃縮された上清サンプル (7.5 μL) を 1.5 mL 微量遠心管中で 2 × Laemmli 緩衝液染色剤、Bio-Rad (2.5 μL) と混合しました。サンプルをウォーターバス内で 100 °C で 10 分間加熱し、遠心分離しました (12,000 rpm、10 分間)。抗生物質で選択された細菌性病原体上清中のタンパク質を、SDS-PAGE 10% 勾配 Novex Tris-グリシン分離ゲル (Invitrogen、カールスバッド、カリフォルニア州、米国) によって分離しました。 130 V で 1 時間電気泳動分離した後、ゲルを 50% MeOH、10% HoAC、40% H2O で 20 分間固定しました。ゲルが均一な青色になるまで、適切な量（１００～２５０ｍＬ）の染色溶液（０．２５％クーマシーブルーＲ－２５０）を含むプラスチックトレイにゲルを置いた。ゲルが色素溶液中に見えなくなったとき、染色は完了した。ゲルの脱色には、背景が透明になるまで、87.5% dH2O 中の 5% MeOH および 7.5% HoAC を使用しました。ゲルは 7% HoAC 中で保存されました。

タンパク質の消化では、過剰なポリアクリルアミドを最小限に抑えるためにバンドを切断し、多数の小さな断片に分割しました。ゲル片を水で洗浄し、アセトニトリル中で脱水した。次にバンドを DTT で還元し、ゲル内消化の前にヨードアセトアミドでアルキル化しました。 50 mM 重炭酸アンモニウム中の 5 μL 10 ng/μL トリプシンまたはキモトリプシンを加え、室温で一晩インキュベートして完全な消化を達成することにより、トリプシンを使用してすべてのバンドをゲル内で消化しました。形成されたペプチドを、５％ギ酸を含む５０％アセトニトリル３０μＬの２つのアリコート中のポリアクリルアミドから抽出した。これらの抽出物を合わせて、Speedvac で 10 μL 未満になるまで蒸発させた後、1% 酢酸に再懸濁して、LC-MS 分析用に最終容量を約 30 μL にしました。 LC-MS システムは、CaptiveSpray イオン源と組み合わせた陽イオンモードで動作する Bruker TimsTof Pro2 Q-Tof 質量分析システム (どちらも Bruker Daltonik GmbH、ブレーメン) でした。ＨＰＬＣカラムは、Ｂｒｕｋｅｒ１５ｃｍ×内径７５μｍＣ１８ＲｅｐｒｏＳｉｌＡＱ、１．９μｍ、１２０Å逆相キャピラリークロマトグラフィーカラムであった。１μＬ量の抽出物を注入し、流速０．３μＬ／分のアセトニトリル／０．１％ギ酸勾配によってカラムから溶出したペプチドをオンラインの質量分析計のソースに導入した。並列蓄積-連続断片化 DDA メソッドを使用してダイジェストを分析し、TIMS-MS スキャンとその後の 10 回の PASEF MS/MS スキャンによる断片化のための前駆体イオンを選択しました。 TIMS-MS サーベイスキャンは、166 ms のランプ時間で 0.60 ～ 1.6 Vs/cm2、100 ～ 1700 m/z で取得されました。 PASEF スキャンの合計サイクル時間は 1.2 秒で、MS/MS 実験は 20 eV (0.6 Vs/cm2) ～ 59 eV (1.6 Vs/cm2) の衝突エネルギーで実行されました。 2 ～ 5 の電荷を持つ前駆体が、ターゲット値を 20,000 au、強度閾値を 2500 au に設定して選択されました。前駆体は、0.4 秒間動的に除外されました。データは、Uniprot プログラム MSFragger を使用してコンパイルされた Ab データベースを検索するための実験で収集されたすべての CID スペクトルを使用して分析されました。この検索のパラメーターには、20 ppm の前駆体質量精度と 0.05 Da のフラグメント質量精度、2 つの許容切断ミスを含む完全トリプシンペプチド、可変修飾としての酸化メチオニンとタンパク質の N 末端アセチル化、および静的修飾としてのカルバミドメチル化が含まれます。タンパク質とペプチドの同定は、おとりデータベース戦略を使用して 1% FDR まで検証されました。

私たちの配列アラインメント法は、データベース検索に簡単な方法で使用されました。 Schrodinger パッケージ ver. の複数配列アラインメントツール古典的な Smith-Waterman アルゴリズムに基づく 2019-3 が使用されました。比較配列データベースは、UniProt および NCBI Protein Data Bank によって提供されました。

現在の研究中に生成されたデータセット、および/または現在の研究中に分析されたデータセットは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。また、質量分析プロテオミクスデータは、データセット識別子 PXD042336 とともに PRIDE パートナーリポジトリを介して ProteomeXchange コンソーシアムに寄託されています。

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Woo Shik Shin への研究支援は、ノースイーストオハイオ医科大学薬学部から提供されました。ノースイーストオハイオ医科大学薬学部は、必要な研究リソースをすべて提供しました。

この研究は、国立衛生研究所の助成金 (1R01AG076699、Woo Shik Shin に) およびノースイーストオハイオ医科大学からのスタートアップ/トランスレーショナルリサーチシード助成金によって支援されました。

これらの著者は同様に貢献しました: Trae Hillyer と Bogdan M. Benin。

ノースイースト・オハイオ医科大学薬学部、米国オハイオ州ルーツタウン

トレイ・ヒリヤー、ボグダン・M・ベニン、ノア・アギーレ、シン・ウ・シク

カリフォルニア大学神経内科、ロサンゼルス、カリフォルニア州、米国

サン・チュアンキ

プロテオミクスおよびメタボロミクスコア、ラーナー研究所、クリーブランドクリニック、米国オハイオ州クリーブランド

ベリンダ・ウィラード

米国ミネソタ州ミネアポリス、ミネソタ大学統合生物学および生理学学部

ユク・イン・シャム

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TH と NA は、Ab19606 サンプルを増殖させ、プロテオミクス用のサンプルを準備しました。 BW はプロテオミクス測定とペプチドの同定を実施しました。 CSは精製され、TEM-1コントロールタンパク質が提供されました。 BMBは結果を分析した。 BMB と WSS が原稿を書きました。 WSSが監修しました。 WSS と YYS がプロジェクトを設計しました。 TH と BMB はこの作業に等しく貢献しました。著者全員が結果について議論し、原稿についてコメントしました。

シン・ウシクさんへの手紙。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガーネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

Hillyer、T.、Benin、BM、Sun、C. 他。アシネトバクター・バウマニにおけるβ-ラクタム系抗生物質誘発性薬剤耐性パターンを特徴付ける新規戦略。 Sci Rep 13、9177 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-36475-9

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受信日: 2022 年 12 月 8 日

受理日: 2023 年 6 月 4 日

公開日: 2023 年 6 月 6 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-36475-9

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