セルロース ナノファイバー/ポリ (ビニル アルコール) 多孔質ヒドロゲルの機能化と特性評価および生物学的応用のためのエジプト産プロポリス抽出物

Scientific Reports volume 13、記事番号: 7739 (2023) この記事を引用

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ミツバチのプロポリスは最も一般的な天然抽出物の 1 つであり、天然物の抗酸化活性の原因となるフェノール酸とフラボノイドが豊富に含まれているため、生物医学で大きな関心を集めています。 今回の研究では、プロポリス抽出物（PE）が周囲環境中のエタノールによって生成されたことを報告しています。 得られたPEをさまざまな濃度でセルロースナノファイバー(CNF)/ポリビニルアルコール(PVA)に添加し、凍結融解および凍結乾燥法を行って多孔質生理活性マトリックスを開発した。 走査型電子顕微鏡 (SEM) 観察により、調製したサンプルが 10 ～ 100 μm の範囲の孔径を持つ相互接続された多孔質構造を持っていることが示されました。 PE の高速液体クロマトグラフィー (HPLC) の結果では、約 18 種類のポリフェノール化合物が示され、ヘスペレチン (183.7 μg/mL)、クロロゲン酸 (96.9 μg/mL)、カフェ酸 (90.2 μg/mL) が最も多く含まれていました。 抗菌活性の結果は、PE および PE 官能化ヒドロゲルの両方が、大腸菌、ネズミチフス菌、ミュータンス連鎖球菌、およびカンジダ アルビカンスに対して潜在的な抗菌効果を示すことを示しました。 インビトロ試験細胞培養実験では、PE 官能基化ヒドロゲル上の細胞が最も優れた生存率、接着性、および細胞の拡散性を有することが示されました。 まとめると、これらのデータは、生物医学用途の機能性マトリックスとしての CNF/PVA ハイドロゲルの生物学的特徴を強化するプロポリスの生体機能化の興味深い効果を強調しています。

三次元 (3D) 組織様生体適合性材料の最も顕著な用途は、損傷後の組織の再生または治癒を指示することです。 これは、生化学的、生物物理学的手がかり、そして場合によっては機械的刺激を使用して細胞機能を強化することにより、生理学的微小環境を最適化するこれらの材料の能力に依存しています 1,2。 実際、生理活性物質は、細胞の増殖と分化を誘発するだけでなく、治癒プロセスを遅らせる可能性がある炎症反応を最小限に抑える際に、複数の重要な役割を果たします 3,4。 ハイドロゲルは、皮膚、軟骨、骨、血管などのさまざまな組織の治癒に適用できるスマートな生体材料です5。 それらは天然の細胞外マトリックス (ECM) と同様の最適な (3D) 構造を提供し、弾性架橋ネットワークを介してガス、栄養素、老廃物の拡散を可能にします6。 過去数十年にわたり、天然または合成起源のさまざまなポリマー材料が機能性ヒドロゲルの開発に使用されてきました。 繊維強化ヒドロゲルは複合ヒドロゲルの一種であり、通常、ゲルネットワークが繊維構造で強化されて機械的性能が向上し、また膨潤挙動も抑制されます7、8、9。

セルロースは地球上で最も豊富な天然由来のポリマーであり、植物の細胞壁といくつかの動物細胞の主成分です10。 これは、β (1→4) エーテル結合 (グリコシド結合) によって結合された β-d-アンヒドログルコピラノース単位からなる直鎖ホモ多糖です。 形成されたセルロース鎖は水素結合によって結合され、非晶質領域と結晶質領域からなるフィブリルを形成します。 CNF は、非晶質ドメインと高度に秩序化されたドメインが交互に結合した特定のクラスのナノセルロースを意味し、通常はセルロースフィブリルの機械的崩壊によって得られます 11、12。 その結果、CNF は、高い強度、表面積、および調整可能な表面化学を示すナノサイズの生体材料を出現させ、ポリマー、ナノ粒子、小分子、および生体材料との制御された相互作用を可能にしています。 たとえば、CNF はアルギン酸塩とポリビニルアルコールの溶液に埋め込まれ、リン酸カルシウムのその場での石灰化を促進する安定したヒドロゲルを形成しました 13。 また、カルボキシル基を有する2,2,6,6-テトラメチルピペリジン-1-オキシル（TEMPO）酸化CNFを、カルボキシル基のアミド化により大豆タンパク質加水分解物にグラフトさせた。 グラフトされた CNF は、2 回シミュレーションされた体液からのヒドロキシアパタイトの石灰化を促進し、新しい生物活性物質を形成しました 14。

生体適合性合成ヒドロゲルの製造に使用される親水性ポリマーの 1 つは、半結晶性ポリマーである PVA です。 PVA ハイドロゲルは物理的に架橋して、生体膜に匹敵する微細構造と変形特性を備えた多孔質生体適合性材料を生成することができるため、生物医学用途に最適です 15,16。 PVA の物理的架橋は、凍結と解凍のサイクルを繰り返すことで実行できます。 この方法では、調製した PVA 溶液を凍結させることで氷の結晶が形成され、PVA 鎖が押しのけられ、閉じ込められた空間にそれらが詰め込まれます。 ポリマーの結晶化はこれらの領域で起こります。 その後、解凍プロセスを通じて氷の結晶が溶け、結晶が架橋結合として機能する多孔質のクライオゲルが形成されます17。 従来のハイドロゲルは、安全性、生体適合性、高い親水性などの優れた特性を備えていますが、生物学的性能には限界があります。 今日、ヒドロゲルと治療薬（すなわち、薬物、天然抽出物、機能性タンパク質、または遺伝子）との組み合わせは、組織再生プロセスにとってより好ましい環境を提供し、治療薬の急速な代謝を回避する効果的な方法となっています18。

プロポリスは養蜂の自然な副産物であり、古代から傷の治癒に使用されてきました。 プロポリスには 300 以上の化合物が存在し、その色は地域の植生や植物源によって異なります。 地域の植生に応じて、黄緑色または濃い茶色になることがあります19。 プロポリスは巣の亀裂を守るだけでなく、蜂の巣細胞を強化し、微生物の侵入から巣を守ります20。 プロポリスの主なポリフェノール成分はフラボノイドとフェノール酸エステルで、次に芳香族酸、リグナン、テルペノイドが続きます21。 通常、混合物の 30% はミツロウ、5% は花粉、50% は樹脂と植物性バルサムで構成されます21。 プロポリスには、バルサミコ状、樹脂状、ゴム状の物質に加えて、花粉、唾液、ワックスも含まれており、ミツバチによる浸出液や植物の新芽に由来します22。

プロポリスの抗菌特性はフラボノイドによるもので、グラム陽性菌やグラム陰性菌に対して効果的です23。 抗菌、抗真菌、抗ウイルス、抗炎症、抗癌、抗腫瘍特性など、多くの生物学的特性がプロポリスに関連しています24,25。 プロポリスベースの材料は、創傷治癒材料として応用されています。 たとえば、クリームとしてのプロポリスは、皮膚組織の治癒を促進し、スルファジアジン銀よりも傷の炎症を軽減するために使用されます26。 毒性やアレルギー反応を起こすことなく、皮膚細胞の増殖、活性化、成長能力を促進します。

最近、機能性ヒドロゲルは、その親水性、柔軟性、生体組織に対する固有の接着力により、組織工学および再生用途で大きな注目を集めています。 これらの特有の特性は、生物学的標的と直接接触する特定の治療成分の滞留時間を延ばす上で重要な役割を果たします。 したがって、本研究は、化学的架橋に関与する架橋剤との望ましくない副相互作用のない、PEの効果的な組み合わせのための安全な物理架橋ハイドロゲルとして、凍結と解凍の繰り返しサイクルを使用してPVAとCNFから3Dハイドロゲルを調製することを目的としています。 -結合ヒドロゲル。 PE を担持したヒドロゲルの微細構造の特徴を、フーリエ変換赤外分光法 (FT-IR)、SEM、および X 線回折 (XRD) によって分析しました。 さらに、インビトロ試験細胞の生存率とヒト正常線維芽細胞 (HFB4) への付着を測定しました。 最後に、図 1 に要約されているように、抗菌および抗炎症の可能性も調査されました。

現在の研究における 5 つの主要なステップの概略図: (A) プロポリス抽出物。 (B) 漂白バガスに基づく CNF の調製。 (C) PE を充填した CNF/PVA。 (D) 得られたサンプルの微細構造の特性評価。 (D) 生物学的応用。

PE の化学組成は、ミツバチの食物源に応じて異なる場合があります。 したがって、PE の化学組成を図示し、特定の化合物の有無を強調することが重要です。 表 1 および図 2 に示すように、HPLC 検出法により、PE 中の 18 種類のポリフェノール化合物を同定できました。これらは、PE の生物活性において極めて重要な役割を果たしています。 PE に示されている含有量が最も高いポリフェノール化合物は、ヘスペレチン (183.73 μg/mL)、クロロゲン酸 (96.92 μg/mL)、コーヒー酸 (90.28 μg/mL)、ダイゼイン (67.89 μg/mL)、およびアピゲニン (66.59 μg/mL) でした。 ）。 一方、ルチンとバニリンの濃度はそれぞれ 0.8 μg/mL、0.7 μg/mL と低濃度でした。 一方、標準と比較した場合、PE にはカテキンが唯一観察されませんでした。 表 2 に示すように、プロポリスの地理的起源と抽出溶媒は、ポリフェノール化合物の入手可能性と濃度に影響を与える主な要因です。

PE の HPLC フィンガープリント。

セルロースの一級ヒドロキシル基の選択的酸化（図 3A）の場合、TEMPO 媒介酸化は、反応性カルボン酸基を生成する C-6 酸化に適した方法です。 図 3B は CNF の FT-IR スペクトルを示しており、セルロース鎖の特徴的なピークを示しています 35。 しかしながら、TEMPO酸化プロセスによるカルボニル基(C=O)の伸縮に起因する新しいバンドが1739cm-1に見られた。 調製されたCNFは、図3Cに報告されているXRDパターンによって確認されました。 天然セルロースの特徴である 16.4° (110) と 23.1° (200) に 2 つの主な回折ピークが示されています。 また、結晶化度のパーセンテージは Segal 法に従って推定され、約 73% と記録されました 36。 CNFの内部構造も透過型電子顕微鏡（TEM）分析を用いて調べた。 図 3D は、画像解析によって計算された、マイクロメートル単位の長さと 4 ～ 20 nm の範囲の直径を持つ CNF を示しています。 さらに、ナノファイバーは、ファイバーの表面にカルボン酸基が均一に形成されているため、均一な構造を示しました。

セルロース系材料の化学分析 (A) セルロースの FT-IR、(B) CNF の FT-IR、(C) CNF の XRD、(D) CNF の TEM 画像。

実際、ポリマーヒドロゲルは、物理的または化学的架橋、あるいはその両方によって製造されます。 物理的に架橋されたヒドロゲルは弱い相互作用によって得られますが、ヒドロゲルが化学的に架橋されると化学的共有結合が形成されます。 このうち、PVAハイドロゲルは凍結融解法により簡単に形成することができます。 この研究では、CNF と PVA をベースとした PE 担持ハイドロゲルを、凍結と解凍を連続して実行した後、単純な物理的架橋によって調製し、続いて凍結乾燥して多孔質 3D 構造を生成しました。 図 4A ～ C は、CNF/PVA、CNF/PVA/PE1、および CNF/PVA/PE2 繊維強化ハイドロゲルの表面の SEM 画像と、同じハイドロゲル サンプルの断面画像を示しています。 図 4D は、同じヒドロゲルの断面画像を示しています。 断面と表面の画像により、サイズが 10:100 μm まで変化する不規則な細孔を持つ 3D の粗く相互接続された多孔質構造の形成が確認されます。 この微多孔構造は酸素と栄養素の輸送を促進するため、細胞の動員にとって非常に重要です。 ヒドロゲルに PE を導入すると、細孔サイズと表面粗さが減少します。 この細孔サイズの減少は、生体内に移植された場合の迅速な放出を促進するヒドロゲルの表面に PE が存在することを示唆しています。 PE などの抗菌剤の迅速な放出は、細菌の侵入を阻止するために重要です。

異なる倍率での繊維強化ヒドロゲルの SEM 画像 (×200、×500 および ×1000)、および同じサンプルの関連する断面画像 (×200)。 (A) CNF/PVA、(B) CNF/PVA/PE1、(C) CNF/PVA/PE2。

図 5 は、PE および PE を添加した PVA/CNF ハイドロゲルサンプルの FT-IR スペクトルを示しています。 PE サンプルの IR スペクトル（図 5A）は、3410 cm-1 を中心とする広帯域を示しています。これは通常、フェノール化合物の OH 伸縮振動に起因すると考えられます 37。 2920 および 2840 cm-1 の 2 つのバンドは、それぞれ炭化水素化合物の C-H 非対称および対称伸縮に関連しています 38。 一方、1720 および 1460 cm-1 のバンドは、フラボノイドおよび脂質含有量のカルボニル C=O 伸縮振動に割り当てられます。 さらに、1370 および 1271 cm-1 のバンドは、それぞれ C-H 基のハサミ振動と C-O-H 伸縮振動によるものです 39。 最後に、1165、1040、および 870 cm-1 のバンドは、アルケンの C=C 結合の伸縮振動、芳香族エーテルの C-O-C 結合、およびフェノール化合物の C-H 揺れ振動に関連しています。

(A) PE、(B) CNF/PVA、(C) CNF/PVA/PE1 および (D) CNF/PVA/PE2 繊維強化ヒドロゲルの FT-IR スペクトル。

一方、CNF/PVAヒドロゲルのFT-IRスペクトルは、図5Bに示すように、3294 cm-1に広いバンドを示します。これは、PVAとCNFの両方の水酸基のOH伸縮振動によるものです。 。 2905、1708、1420 cm-1 のバンドはそれぞれ C-H 伸縮、C=O 伸縮、CH2 曲げ振動に属します。 1040 および 870 cm-1 の他のバンドは、C-O および CH2 伸縮振動に関連しています 41。 CNF/PVA/PE1 および CNF/PVA/PE2 繊維強化ヒドロゲルの FT-IR スペクトルをそれぞれ図 5C および D に示します。 両方のサンプルのスペクトルは、いくつかの変更を加えて、CNF/PVA ハイドロゲルに関連するピークを示します。 たとえば、O-H 伸縮バンドは、CNF/PVA/PE1 サンプルと CNF/PVA/PE2 サンプルでそれぞれ 3335 cm-1 と 3351 cm-1 にシフトしました。 さらに、C=O 伸縮バンドは、CNF/PVA/PE1 サンプルでは 1739 cm-1 で、CNF/PVA/PE2 サンプルでは 1725 cm-1 で観察されました。 これらの変化を総合すると、CNF/PVA ポリマー マトリックスとプロポリスの間の相互作用に起因すると考えられます 41。

CNF/PVA、CNF/PVA/PE1、および CNF/PVA/PE2 繊維強化ヒドロゲルの水の取り込みまたは膨潤挙動の傾向を図 6 に示します。すべてのサンプルの水取り込みの比率は高く、時間の経過とともに徐々に増加します。 。 これは、サンプルの高多孔質構造を指しており、水がヒドロゲルを通って容易に拡散することができます。 図６に示すように、ＰＥを添加したサンプル（ＣＮＦ／ＰＶＡ／ＰＥ１およびＣＮＦ／ＰＶＡ／ＰＥ２）は、ニート（ＣＮＦ／ＰＶＡ）のサンプルよりも低い吸水率を示す。 たとえば、12 時間の時間間隔では、CNF/PVA の水分摂取率は約 907% ですが、CNF/PVA/PE1 および CNF/PVA/PE2 ではそれぞれ 648% と 590% です。 したがって、CNF/PVA/PE1 および CNF/PVA/PE2 繊維強化ハイドロゲルに PE が存在すると、水分取り込み能力が低下します。これは、SEM 観察から示されるように、PE の疎水性と細孔サイズの減少に起因すると考えられます (図4）40．

異なる時間間隔でのサンプル CNF/PVA、CNF/PVA/PE1、および CNF/PVA/PE2 の含水率 (%)。

プロポリスは植物のつぼみや花から抽出される樹脂状の物質で、微生物汚染に対する保護剤として使用されます42。 ポリフェノールは PE の主要な化学成分であり、PE の抗菌活性を担っています 43。 PE および CNF/PVA、CNF/PVA/PE1、および CNF/PVA/PE2 繊維強化ハイドロゲルの抗菌作用が、さまざまなアプローチを使用してヒトの病原体に対して調査されました。 PE の抗菌活性を表 3 および図 7 に示します。PE は研究したすべての微生物に対して抗菌の可能性を示しましたが、Atik らによって報告されているように、S. typhimurium には影響を与えません 44。 対照の CNF/PVA ハイドロゲルは、研究対象の微生物に対して効果がありません。 結果は、グラム陽性菌（S. mutans）に対して有意に高い抗菌活性を示しましたが、グラム陰性菌（E. coli）と C. albicans の間には有意差はありませんでした。 さらに、MIC もさまざまな濃度での抗菌活性の調査を通じて決定されました。 大腸菌に対する PE の MIC は 0.012 mg/mL、S. ミュータンスに対する 0.05 mg/mL、および C. アルビカンスに対する 0.025 mg/mL でした。 一方、異なる濃度のPEを含むCNF/PVA繊維強化ハイドロゲルは、使用した菌株に対して抗菌作用を示し、最も高い抗菌活性がネズミチフス菌で観察され、次にミュータンス菌、そしてその他の微生物では有意差は見られなかった。 。 PE の抗菌挙動の違いは、グラム陽性菌と陰性菌の細胞壁の違いによるものと考えられます 45。 抗菌剤としての PE の活性は、PE の主要なポリフェノール化合物であるヘスペレチン (183.7 μg/mL)、クロロゲン酸 (96.9 μg/mL)、およびコーヒー酸 (90.2 μg/mL) の割合が高いことに関連しています。 表 1 に示すように、PE からの 3 つの化合物としてヘスペレチン、クロロゲン酸、コーヒー酸が高濃度で報告されました。 ヘスペリジンの酵素的加水分解からヘスペレチンが得られ、グラム陽性菌およびグラム陰性菌に対する抗菌活性が評価された。その結果、ヘスペレチンがヘスペリジンおよびヘスペリジングルコシドよりも効果的にモデル微生物を阻害することが明らかになった46。Yen et al.47。 クロロゲン酸は高圧下での生コーヒー豆の水抽出物の主成分の一つであり、グラム陽性菌（黄色ブドウ球菌およびリステリア・イノクア）とグラム陰性菌（大腸菌およびサルモネラ・エンテリカ）の両方に対して抗菌活性を示すことを発見した。 カフェ酸とその抗生物質フィトケミカルとの組み合わせが黄色ブドウ球菌に対して評価されたところ、その結果、黄色ブドウ球菌に対する多様な効果が示され、MIC は 256 ～ 1024 μg/mL の範囲でした48。 試験したポリフェノール化合物のほとんどは、単一化合物として試験した場合には使用したモデル微生物に対して効果がありませんでしたが、他の化合物と組み合わせると抗菌剤の活性が増加しました。 Ahmed らによると、49 200 および 400 μg/mL の没食子酸は、黄色ブドウ球菌および化膿ブドウ球菌に対しては効果がありましたが、グラム陰性菌に対しては効果がありませんでした。 一方、オリーブ工場の廃水から抽出した反溶媒と没食子酸を組み合わせたものを、低い最小阻止濃度を使用してテストしたところ、50/100 ～ 100/100 μg/mL では、使用したすべての細菌の完全な増殖阻害が引き起こされることが明らかになりました。使用したモデル細菌に対するフェノール化合物の相乗効果。 他の研究では、ブドウの搾りかすから抽出したポリフェノール化合物と、β-ラクタム、キノロン、フルオロキノロン、テトラサイクリン、アンフェニコールなどの代表的な異なるクラスの抗生物質を組み合わせると、分別阻止濃度で試験したすべての黄色ブドウ球菌および大腸菌株において相乗効果を発揮することが報告されています。インデックス (FICI) 値は 0.031 ～ 0.155 の範囲で変化します。 フェノール化合物とさまざまな抗生物質の相乗効果により、MIC は 4 ～ 75 分の 1 に減少しました50。 以前の研究では、プロポリスによる複合膜の生物学的評価を改善することが促進されています。たとえば、ポリ乳酸/精油51、ポリ-ε-カプロラクトン52、バクテリアセルロース/ZnO-NPs53、キトサン/Ag-NPs54、ポリウレタン/ナノリグニン55などです。 抗菌活性を持つ PE 由来の主な生理活性ポリフェノール化合物を表 4 にまとめます。

4 つの病原菌に対する抗菌活性は、寒天ウェル拡散法によるさまざまな濃度の PE のハローゾーン (A) およびディスク拡散法による CNF/PVA、CNF/PVA/PE1、および CNF/PVA/PE2 繊維強化ヒドロゲル (B) として表されます。微生物。

HFB4 細胞を PE とともに培地中 37 °C で 24 時間インキュベートして、完全な単層シートを生成しました。 異なる濃度の PE を 1000 μg/mL の濃度まで適用しました。 MTT によれば、125 μg/mL を超える濃度の PE が細胞生存率を大幅に低下させることが観察されました (図 8)。 125 μg/mL までの濃度は細胞生存率に影響を与えませんでした。 さらに、光学顕微鏡を使用して、異なる用量のPEでHFB4細胞を処理したときの細胞増殖を確認した。 PE濃度の増加による細胞数の減少は、対照と比較して明らかに見られました(図8)。 これらの結果は、125 μg/mL の制限を超える PE 濃度が HFB4 細胞に有害な影響を引き起こす可能性があることを示しています。 以前の研究では、天然抽出物を補給すると、in vitro および in vivo 試験で反応種の生成と酸化ストレスが増加し、酸化損傷や細胞死につながる可能性があることが実証されました 73,74。

さまざまな濃度 (31.25 ～ 1000 μg/mL) の PE で 24 時間処理した HFB4 細胞の生存率。 データは、未処理細胞（対照）におけるホルマザン形成の平均パーセンテージとして表した。 データは 3 つの独立した実験 (各実験につき 6 回の反復) から得られました。 (*) は対照と比較して p が 0.05 未満、**p が 0.05 より大きいことを意味します。

図９は、ヒドロゲルの異なるサンプルで処理した場合の、ＭＴＴアッセイによって決定されたＨＦＢ４細胞の生存率を示す。 PE を含むサンプル (CNF/PVA/PE1 および CNF/PVA/PE2) で処理した細胞の生存率は、PE を含まない CNF/PVA サンプルよりも優れています。 これは、PEの存在がHFB4細胞の生存率を高めることを反映しています。

（A）MTTアッセイを使用した細胞生存率、（B〜D）それぞれCNF / PVA、CNF / PVA / PE1、およびCNF / PVA / PE2繊維強化ヒドロゲルに播種して24時間後のHFB4細胞のSEM顕微鏡写真。 (*) は対照と比較して p が 0.05 未満、**p が 0.05 より大きいことを意味します。

CNF/PVA、CNF/PVA/PE1、および CNF/PVA/PE2 繊維強化ハイドロゲルで処理した HFB4 細胞の伸長と接着の SEM 画像を図 9 に示します。 見られるように、播種されたすべての細胞は丸い形状をしています。定着プロセス中の脱水が原因である可能性があります。 プロポリスを添加したサンプル (CNF/PVA/PE1 および CNF/PVA/PE2) 上の細胞の広がりは、PE を含まない対照サンプル (CNF/PVA) と比較して高くなります。 また、PE 含量が高いサンプル (CNF/PVA/PE2) の細胞の拡散と付着は、PE 含量が低いサンプル (CNF/PVA/PE1) よりも大きくなっています。 したがって、プロポリスの存在は細胞の成長と接着を促進します。 全体として、この研究で実行された in vitro テストは、3D 環境での細胞接着と拡散を促進する細胞適合性材料として、調製されたプロポリス強化ヒドロゲルの重要性を示しています。

赤血球膜の安定化は、移植された生体材料の抗炎症効果を調査するための確立されたアッセイです。 炎症は、分解されたリソソーム小胞からのさまざまな酵素の放出により発生します75。 したがって、赤血球膜の安定化は、これらの酵素の漏出と炎症の発生を防ぎます75。 溶血試験は、特に血液と接触する物質にとって非常に重要な試験です。 表５は、ＰＥ、ＣＮＦ／ＰＶＡヒドロゲルのサンプル、およびプロポリスを充填したサンプル（ＣＮＦ／ＰＶＡ／ＰＥ１およびＣＮＦ／ＰＶＡ／ＰＥ２）の溶血阻害の結果を説明する。 インドメタシン薬は中傷薬 (陽性対照) として使用され、低張性による RBC の溶解に対して 200 μg/mL の濃度で最も高い保護 (100 ± 2.362%) を示しました。 表 2 に示すように、すべてのサンプルは濃度依存的にヒト赤血球を保護します。 CNF/PVA/PE2 サンプルと PE の保護効果は、濃度が異なってもほぼ同じです。 最も低い保護効果は、CNF/PVA サンプル (PE なし) で記録されています。 これらの発見から、PE を充填したヒドロゲルが抗炎症剤として有望であることは明らかです。

プロポリスは、さまざまな生物学的用途にとって高い価値を持つ天然の副産物です。 PE の HPLC 分析により、約 18 種類のポリフェノール化合物が明らかになり、最高濃度はヘスペレチン、次いでクロロゲン酸、コーヒー酸でした。 CNFはサトウキビの漂白バガスから得られたセルロースの酸化解繊によって調製され、さまざまな濃度のPEを担持した持続可能な多孔質CNF/PVAの調製に使用されました。 調製された足場は、最大 100 μm の孔径を持つ高多孔質構造を示しました。 得られたPE担持CNF/PVAヒドロゲルは、大腸菌、ミュータンス菌、そしてカンジダ・アルビカンスに対して高い抗菌活性を示します。 細胞反応は、PE 官能化 CNF/PVA ハイドロゲル上の細胞が HFB4 細胞の付着と増殖に最適な微環境を明らかにしていることも示しました。 注目すべきことに、我々の結果は、CNF/PVA の PE 官能基化が PE 担持 CNF/PVA ハイドロゲルの抗菌特性を強化するだけでなく、顕著な抗炎症能ももたらすことを示唆しました。 したがって、創傷治癒における PE 担持 CNF/PVA ハイドロゲルの効力を強調するために、臨床応用の前に in vivo 実験を行うことが強く推奨されます。

漂白バガスパルプは、エジプトのPaper IndustryのQena Companyから入手した。 TEMPO はメルクから購入しました。 臭化ナトリウムは Sigma-Aldrich から購入しました。 この研究で使用されたプロポリス原料は、2022 年 7 月に地元の養蜂家 (エジプト、ダカリア、マンスーラ) から収集されました。ポリビニル アルコール - PVA (分子量 85,000 ～ 124,000 g/mol、99.1% 加水分解) は Sigma-Aldrich から購入しました。 この研究では、水酸化ナトリウム、蒸留水、エタノールも使用されました。

PE は、Bozkuş et al.31 に従って、少し変更を加えて収集されました。 簡単に説明すると、約 10 g の原料を 100 mL の 70% エタノールに溶解し、暗所で 37 °C のインキュベーターに 14 日間置きました。 Whatman 濾紙 (No. 1) を使用して濾過した後、混合物を 5000 rpm で 15 分間遠心分離し、重量が一定になるまで 40 °C で 5 日間オーブン乾燥しました。 得られたPEは、使用するまで冷蔵庫に保管した。

Kong らによると、PE のポリフェノール (フェノールおよびフラボノイド) 化合物は、わずかに変更を加えて HPLC (Agilent 1260 シリーズ、米国) によって分析されました 76。 クロマトグラフィー条件: クロマトグラフィー分離は Eclips C18 カラム (4.6 × 250 mm、5.0 μm) で実行されました。 移動相は、(A) 水および (B) アセトニトリル中の 0.05% トリフルオロ酢酸からなり、流速 1 mL/min でした。 溶媒勾配は次のとおりです。0 分 82% A、0 ～ 5 分 80% A、5 ～ 8 分 60% A、8 ～ 12 分 60% A、12 ～ 15 分 82% A、15 ～ 16 分 82% A 、および 16 ～ 20 分間 82% A。多波長検出器は 280 nm で監視されました。 注入量は各サンプル溶液につき 5 μl でした。 カラム温度は 40 °C に維持しました。

漂白バガスは、Salama et al.35 によって記載された方法を使用して、TEMPO 酸化 CNF の調製に使用されました。 簡単に説明すると、２０ｇの漂白バガスパルプをＴＥＭＰＯ（０．８ｇ）および臭化ナトリウム（８ｇ）とともに蒸留水中に分散させた。 これに続いて、３００ｍＬの次亜塩素酸ナトリウム溶液（１５％）を連続的に添加し、ＮａＯＨ（３ｍｏｌ／Ｌ）溶液を使用してｐＨを１０に調整した。 反応の終わりに、pH を 7.0 に下げ、生成物を 10,000 rpm で数回遠心分離しました。 脱イオン水を使用した透析を行って生成物を精製した。

CNF/PVA 多孔質ヒドロゲルは、Müller et al.77 に従って凍結融解および凍結乾燥法を使用して調製されました。 ポリマー重量比を５０：５０（ＣＮＦ：ＰＶＡ）に調整した。 簡単に説明すると、95 °C で磁気撹拌を使用して、蒸留水中で濃度 10 wt% の PVA 溶液 30 mL を調製しました。 ４時間後、１００ｍＬのＣＮＦ溶液（３重量％）をＰＶＡ溶液に添加し、５０００ｒｐｍで１０分間機械的に撹拌した。 次に、CNF/PVA 混合物を 10 cm の丸型に注ぎ、-40 °C で 3 時間凍結させ、続いて室温で 3 時間解凍して PVA を架橋させました。 得られたヒドロゲルを 4 回の凍結融解サイクルに供し、続いて -80 °C で凍結乾燥しました。 PE 担持 CNF/PVA ヒドロゲルを製造するには、異なる割合の PE (0.1 および 0.2 g) を 2 mL のエタノールに溶解し、22 mL の CNF/PVA 懸濁液混合物に加えました。 混合物をマグネチックスターラー上で40℃で1時間保持して、PEの完全な溶解を確実にした。 前述のように、丸い型に注ぐ前に、5000 rpmで10分間機械的撹拌を使用して溶液を均質化し、凍結融解サイクルに供し、最後に-80℃で凍結乾燥しました。 調製したサンプルを、対照（ＰＥなし）についてはＣＮＦ／ＰＶＡ、０．１ｇのＰＥを含むサンプルについてはＣＮＦ／ＰＶＡ／ＰＥ１、０．２ｇのＰＥを含むサンプルについてはＣＮＦ／ＰＶＡ／ＰＥ２と名付けた。

異なる濃度の PE で強化された、調製された CNF/PVA ヒドロゲルの形態を、電界放出走査型電子顕微鏡 (FE-SEM) (JSM 6360LV、JEOL/Noran) を使用して検査しました。 細孔サイズの推定は、Java 1.8.0 ソフトウェア (米国国立衛生研究所 (NIH)) を備えた ImageJ の角度ツールを使用して、さまざまな SEM 画像から決定されました 78。 FT-IR (モデル FT/IR-6100 タイプ A) を使用して、サンプルの化学官能基を調査しました。 スペクトルは 400 ～ 4000 cm-1 の範囲の波数で記録されました。 調製したCNFに形成された相を調べるために、XRDパターンを帝国粉末回折計(Cu Kα、0.154 nm)で5〜70°2θ、ステップサイズ0.01°/秒で記録しました。 超高分解能透過電子顕微鏡（JEOL-2010）を用いてCNFの内部構造を観察しました。

調製されたヒドロゲルの水の取り込みの評価は、Eskandarinia et al.79 に従ってわずかに変更を加えて実施されました。 調製した繊維強化ハイドロゲル (CNF/PVA、CNF/PVA/PE1、および CNF/PVA/PE2) を 1 cm × 1 cm に切断し、正確に重量を量り (Wi)、密閉バイアル内の 37 ℃の蒸留水 10 mL に浸漬しました。 ℃。 予定された時間間隔 (1、2、3、4、5、6、8、および 12 時間) でサンプルをバイアルから取り出し、ティッシュペーパーで吸い取って表面の水を除去し、重量を量りました (Ww)。 サンプルの水の取り込み (膨潤) 比は、次の式に従って指定されます。

PE、CNF/PVA、CNF/PVA/PE1、および CNF/PVA/PE2 繊維強化ヒドロゲルの抗菌活性は、グラム陰性菌 [大腸菌 ATCC 25922 (大腸菌) およびネズミチフス菌を含む 4 つの選択された病原体に対して評価されました。 ATCC 14028 (S. typhimurium)]、グラム陽性菌 [Streptococcus mutans ATCC 25175 (S. mutans)]、および酵母 [Candida albicans ATCC 10231 (C. albicans)]。 すべての微生物は American Type Culture Collection (ATCC) から提供されました。 微生物株を、ビーフエキス０．２、カゼイン酸加水分解物１．７５、デンプン０．１５（％）からなるミュラーヒントンブロス５ｍＬを入れた試験管中で、３７℃で１日間、静置培養（２００ｒｐｍ）下で培養した。 。 プロポリスとさまざまなヒドロゲルサンプルの抗菌活性は、それぞれ寒天ウェルとディスク拡散アプローチによって実行されました。

PE の抗菌作用は、Roy および Rhim80 による寒天ウェル拡散技術をほとんど変更せずに定性的に評価されました。 すぐに、0.5 マクファーランド標準とほぼ等しい濃度または密度の微生物懸濁液 (108 CFU/mL) を、ミューラー ヒントン寒天培地 (2%) を含むペトリ皿表面に広げました。 最小阻止濃度 (MIC) は、微生物標的に対して低い阻止ゾーンを示す PE の最小濃度です。 MIC の測定では、0.1、0.05、0.025、0.012、0.006 mg/mL の異なる濃度のプロポリス (それぞれ 1、2、3、4、5 と表示) を培地ウェル (直径 4 mm) に掘りました。滅菌ガラス状穿孔器で穿孔し、65μLの試験済みプロポリスを充填した。 ネガティブコントロールは、中央のウェルにDMSOをロードすることによって実行されました。

調製した CNF/PVA、CNF/PVA/PE1、および CNF/PVA/PE2 繊維強化ヒドロゲルの抗菌活性は、Yahia et al.81 に従って、若干の変更を加えたディスク拡散アプローチによって実行されました。 簡単に言うと、段階希釈した病原体 100 μL を、異なる濃度のプロポリスをロードした複合膜のディスク (直径 5 mm) とともに、ミューラー ヒントン寒天培地のペトリ皿上に別々に分配しました。 プロポリスを含まない繊維強化ヒドロゲルを対照として使用した。

すべてのプレートを 4 °C で 120 分間放置しました。 試験サンプルの拡散を完了し、モデル微生物を阻害するために、その後 37 °C で 1 日間インキュベートし、抗菌活性は、培養後に展開された阻害ゾーンの直径 (ウェルまたはメンブレンディスクを含む) を測定することによって評価されました。潜伏期間。 無菌状態を確保するために、すべてのメンブレンを適用前に UV 光下で 30 分間滅菌しました。 すべての実験は 3 回実施し、平均結果を表しました。

CNF/PVA、CNF/PVA/PE1、および CNF/PVA/PE2 繊維強化ヒドロゲル、および HFB4 細胞に対する PE の細胞毒性アッセイは、MTT (3-4,5-ジメチル-2-チアゾリル)-2,5 を使用して実行されました。 -ジフェニル-2H-臭化テトラゾリウム）アッセイ82,83。 調製したヒドロゲルを培地で３回すすぎ、次いで２４ウェル組織培養プレートの底に播種した。 24 ウェル プレートに 1 × 105 細胞/mL (1000 μL/ウェル) を播種し、37 °C で 24 時間インキュベートして、完全な単層シートを生成しました。 細胞のシート形成と細胞毒性効果を観察しました。 HFB4細胞を、毒性の物理的兆候、例えば、単層の完全または部分的喪失、丸まり、収縮、または細胞顆粒化についてチェックした。 ＭＴＴ溶液を調製した（ＰＢＳ中５ｍｇ／ｍＬ）（ＢｉｏＢａｓｉｃ Ｃａｎａｄａ Ｉｎｃ．）。 100 μL の MTT 溶液を各ウェルに添加しました。 振盪台上に置き、150 rpm で 5 分間、MTT をメディアに完全にブレンドします。 MTT を代謝させるために 4 時間インキュベート (37 °C、5% CO2) します。 その後、200 μL の DMSO を培養細胞と混合し、生細胞で MTT を還元して得られたホルマザン結晶を可溶化しました。 続いて、分光光度計を使用して、570nmにおける各ウェルの平均吸光度を計算した。 3 つの実験を並行して実行しました。 吸光度は細胞量と直接相関するはずです82,83。 PE の場合、24 ウェル組織培養プレートに 1 × 105 細胞/mL (100 μL/ウェル) を接種し、37 °C で 24 時間インキュベートして、完全な単層シートを生成しました。 細胞のコンフルエントなシートが形成された後、増殖培地を２４ウェルマイクロタイタープレートからデカントした。 次いで、細胞単層を洗浄媒体で２回洗浄した。 試験サンプルの２倍希釈物を、２％血清を含むＲＰＭＩ培地（維持培地）中で作製した。 0.1 mL の各希釈液を異なるウェルでテストし、3 つのウェルを対照として残し、維持培地のみを加えました。 次に、上記と同じ手順を実行しました。

HFB4 細胞は、CNF/PVA、CNF/PVA/PE1、および CNF/PVA/PE2 繊維強化ヒドロゲルを含む 24 ウェル プレートで増殖させました 84。 24 時間のインキュベーション後、細胞を 5% (V/V) グルタルアルデヒドで固定し、エタノールの連続溶液 (70 ～ 100%、各 20 分間) で徐々に脱水しました。 その後、SEM 観察のためにサンプルに金をスパッタリングしました。

赤血球懸濁液の調製は、Anosike et al.75 に従って行われました。 簡単に説明すると、健康なボランティアから採取した約 3 mL の新鮮な全血をヘパリン添加チューブに入れ、3000 rpm で 10 分間遠心分離しました。 上清と同量の生理食塩水を利用して、赤血球を溶解した。 得られた溶解赤血球の体積を測定し、等張緩衝液（１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．４）を用いて４０％ｖ／ｖ懸濁液として戻した。 緩衝溶液は、１Ｌの蒸留水中の０．２ｇのＮａＨ ２ ＰＯ ４ 、１．１５ｇのＮａ ２ ＨＰＯ ４ および９ｇのＮａＣｌから形成された。 戻された赤血球（再懸濁した上清）をそのまま使用した。

等しい重量の CNF/PVA、CNF/PVA/PE1、および CNF/PVA/PE2 繊維強化ヒドロゲルを慎重に粉砕し、蒸留水 (低張液) に懸濁しました。 サンプルの段階的用量 (100、200、400、600、800、および 1000 μg/mL) の低張溶液 5 mL を、遠心分離管の 2 組のペア (用量ごと) に入れました。 サンプルの段階的用量 (100 ～ 1000 μg/mL) の等張溶液 5 mL も、遠心分離管の 2 組のペア (用量ごと) に入れました。 同じ前のステップを PE 樹脂についても行いましたが、粉砕は行われませんでした。 ５ｍＬのビヒクル（蒸留水）を含むチューブと、５ｍＬの２００μｇ／ｍＬのインドメタシンを含む別のチューブを、それぞれ対照チューブとして使用した。 赤血球の懸濁液（0.1 mL）を各チューブに加え、穏やかに混合した。 混合物を室温 (37 °C) で 1 時間インキュベートし、その後、1300 rpm で 3 分間遠心分離しました。 上清内のヘモグロビンの吸光度 (Ab) は、Spectronic (Milton Roy) 分光光度計を使用して 540 nm で推定されました。 溶血率を計算するために、蒸留水の存在下で形成される溶血を 100% と仮定しました。 抽出物による溶血の阻害パーセントは次のように計算されました。

ここで、Ab1 = 等張溶液中の試験サンプルの吸光度、Ab2 = 低張溶液中の試験サンプルの吸光度、Ab3 = 低張溶液中の対照サンプルの吸光度75,85。

すべての実験は 3 回繰り返して行われ、結果は平均 ± 標準偏差として表示されました。 統計分析は、Sigma Stat 3.5 ソフトウェア (Dundas Software Ltd、トロント、カナダ) を使用して、一元配置 ANOVA 検定で実行されました。 P 値 ≤ 0.05 は統計的に有意であるとみなされます。

現在の研究中に使用および/または分析されたデータセットは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。

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SS、AMA: 方法論、調査、形式分析、原案の作成。 A.Salama、A.Saleh、ET: 概念化、方法論、調査、形式的分析、執筆 - レビューと編集。 BAE: 調査、正式な分析、執筆 - レビューと編集。

アーメド・K・サレハ氏への通信。

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サレハ、S.、サラマ、A.、アリ、AM 他。 セルロース ナノファイバー/ポリ (ビニル アルコール) 多孔質ヒドロゲルの機能化と特性評価および生物学的応用のためのエジプト プロポリス抽出物。 Sci Rep 13、7739 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-34901-6

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受信日: 2022 年 12 月 7 日

受理日: 2023 年 5 月 9 日

公開日: 2023 年 5 月 12 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-34901-6

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