進化と代謝工学によるシュードモナス・プチダにおけるグルコースとキシロースからのムコン酸生産

Nature Communications volume 13、記事番号: 4925 (2022) この記事を引用

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メトリクスの詳細

ムコン酸は、既存の石油化学製品や性能の優れたバイオ製品の直接代替化学物質に変換できる、生物特権を持つ分子です。この研究では、理論収量を最大化するためのモデルに基づく戦略を使用して、リグノセルロース加水分解物の主要な炭水化物であるグルコースとキシロースをムコン酸に変換するようにシュードモナスプチダ KT2440 を操作しました。 D-キシロースイソメラーゼ経路を発現するように操作された菌株における適応実験室進化（ALE）と代謝工学を用いて、異種D-キシロース:H+共輸送体（XylE）の変異により主要促進因子スーパーファミリートランスポーター（PP_2569）の発現が増加することを実証した。）、および天然の 3-デヒドロキネートシンターゼをコードする aroB の過剰発現により、グルコースとキシロースから同時に効率的にムコン酸を生成できます。合理的に操作された菌株を使用すると、33.7 g L-1 ムコン酸塩が 0.18 g L-1 h-1 で 46% のモル収率 (最大理論収量の 92%) で生産されます。この工学的戦略は、リグノセルロース糖から他のシキミ酸経路由来化合物の生産に有望である。

リグノセルロースからバイオ燃料や生化学物質を生産するための経済的プロセスの開発は、化石燃料の消費に伴う人為的温室効果ガスの排出を削減するために重要です1,2。生化学的生産のために研究されてきた代謝空間のさまざまな領域の中で、微生物の芳香族異化経路に由来する分子は、実質的な化学的多様性を示します 3,4。注目すべきことに、cis,cis-ムコン酸（以下、ムコン酸塩）は、リグニン由来の芳香族化合物、炭水化物、廃プラスチック由来の芳香族化合物から生成できる、カテコール異化経路の人気のあるプラットフォーム化学物質です5、6、7、8、9。、10、11、12。ムコン酸は生体特権分子 13 であり、アジピン酸やテレフタル酸などの直接代替化学物質 5,14,15 に変換することも、性能の優れたバイオ製品 16,17,18,19,20,21,22,23,24 に変換することもできます。。

炭水化物からのムコン酸の生成は、芳香族アミノ酸生合成のシキミ酸経路に基づいており、組換え大腸菌で最初に実証されました5。エリスロース-4-リン酸 (E4P) とホスホエノールピルビン酸 (PEP) は縮合して 3-デオキシ-d-アラビノヘプツロソン酸 7-リン酸 (DAHP) を形成し、さらにこれが重要な中間体である 3-デヒドロシキミ酸 (3-DHS) に変換されます。シキミテ経路。 3-DHS からは、ムコン酸生合成に関して少なくとも 5 つの経路が報告されています 25、26、27、28、29、30。これらの経路のうち、1つは3-DHSデヒドラターゼ（asbF）を介して中間プロトカテク酸（PCA）を通過し、シキミ酸デヒドロゲナーゼ（aroE）を介してシキミ酸を通過する他の経路よりも高い最大理論収量をもたらします（図1a））29．

全体的な代謝工学戦略の概略図。キシロースを利用するために、大腸菌由来のxylE、d-キシロースイソメラーゼ(xylA)、キシルロキナーゼ(xylB)、トランスアルドラーゼ(tal)、およびトランスケトラーゼ(tkt)を異種発現させた。 E4P と PEP は、フィードバック耐性 DAHP シンターゼ (aroGD146N)70 を介して凝縮されて DAHP を形成しました。 DAHPをムコン酸（MA）に変換するために、Bacillus cereus由来の3-DHSデヒドラターゼ（asbF）と、Enterobacter cloacae由来のPCAデカルボキシラーゼ（aroY）およびその対応する補因子生成タンパク質（ecdB）をコードする遺伝子を異種的に使用した。表現した。 aroB およびカテコール 1,2-ジオキシゲナーゼ (catA) が過剰発現されました 3,32。大腸菌由来の改変コリスミ酸ピルビン酸リアーゼ (ubiC-C22)40 を過剰発現させて、コリスミ酸 (CSA) を PCA および MA に変換できる 4-ヒドロキシ安息香酸 (4HB) に変換しました。欠失した遺伝子は赤色で表示されます。キシロン酸またはグルコン酸の生成を防ぐために、グルコースデヒドロゲナーゼ (gcd) が削除されました。グルコース-6-リン酸イソメラーゼ pgi-1 および pgi-2 はそれぞれ以前に削除されました 3,32 が、この研究では pgi-1 が復元されました。ピルビン酸キナーゼ pykA および pykF は、PEP に対する競合を減らすためにそれぞれ削除されました。 MAを蓄積するために、PCAの開環とMAの異化をそれぞれ防ぐためにpcaHGとcatBCを削除した。リン酸P、2-KGn 2-ケトグルコン酸、2-KG-6-P 2-ケトグルコン酸-6-P、G6Pグルコース-6-P、6PG 6-ホスホグルコン酸、KDPG 2-ケト-3-デオキシ-6-ホスホグルコン酸、 G3P グリセルアルデヒド-3-P、FBP フルクトース-1,6-P2、F6P フルクトース-6-P、S7P セドヘプツロース-7-P、R5P リボース-5-P、Ri5P リブロース-5-P、3PG 3-ホスホグリセレート、CATカテコール、SA シキミ酸、S3P シキミ酸-3-リン酸、ICIT イソクエン酸、CIT クエン酸、AKG アルファ-ケトグルタル酸、SUCC コハク酸、FUM フマル酸、MAL リンゴ酸、GLX グリオキシル酸、OAA オキサロ酢酸、AcCoA アセチル-コエンザイム A. b 最大値の代謝モデリングpgi-1 を使用した場合と使用しない場合の理論上のムコン酸モル収量と炭素収量。青線はasbF経路を表し、赤線はaroE経路を表し、実線はモル収率%を表し、破線は炭素収率%を表します。灰色の領域は、消費されたキシロースのモル百分率 33 ～ 40% (残りはグルコース) を表し、トウモロコシ茎の加水分解物の組成を模倣しています。 c グルコースおよびキシロースでの QP328 株の振盪フラスコ培養。 % モル収量は [mM ムコン酸塩/mM (グルコース + キシロース) × 100] として計算され、% 炭素収量は [mM ムコン酸塩 × 6/mM (グルコース × 6 + キシロース × 5) × 100] として計算されました。エラーバーは生物学的三連の標準偏差を表す。ソースデータはソースデータファイルとして提供されます。

asbFを介して糖からムコン酸を生成するこれまでのいくつかの取り組みでは、aroE10、11、31を欠失させることによってシキミ酸経路を破壊した。 aroE を欠失させると、必須芳香族アミノ酸に対して栄養要求性の菌株が生じますが、これはバイオプロセスにとって望ましくないものです 10,25。最近、シュードモナス・プチダ KT2440 (以下、シュードモナス・プチダ) 株が、asbF3,32,33 を介してグルコースから効率的にムコン酸を生成するように操作されました。ごく最近、我々は、pH 制御されたバイオリアクター内で 0.21 g L-1 h-1 で 22.0 g L-1 の力価とグルコースから 35.6% のモル収率を達成した P. putida の操作を報告しました 32。

現在まで、炭水化物からムコン酸を生成するほとんどの研究では、基質としてグルコースが使用されてきました。しかし、バイオマス加水分解物の価値を高めるには、グルコースとキシロース（多くの場合、リグノセルロース 2 の 2 つの主要な炭水化物）を同時に利用することが重要です。ムコン酸生成のためのグルコースとキシロースの共利用は大腸菌で研究されています11。この以前の研究では、キシロースは炭素異化代謝産物抑制（CCR）を回避するためにTCAサイクルに代謝され、それによりムコン酸収量が制限され、これがこの目標に向けた他の戦略の開発の動機となっています。大腸菌とは異なり、シュードモナス・プチダは本来キシロースを利用できないため、CCR34、35、36、37の非存在下で最適なキシロース経路を設計する機会が得られます。

この研究では、キシロース利用を組み込んで、P.プチダにおけるグルコースとキシロースからの効率的なムコン酸生成を達成することを目指しています。この目的を達成するために、まず hexR を削除し、グルコースからムコン酸を生成するように事前に操作された株に D-キシロースイソメラーゼ経路を操作します (表 1)。代謝モデリング、合理的な菌株工学、適応実験室進化、バイオリアクター培養を組み合わせることで、グルコースとキシロースからのムコン酸生成を改善する成功した戦略を特定します。最後に、代謝フラックスに対する遺伝子改変の影響を推測するためにメタボロミクスが実行されます。

キシロースがペントースリン酸経路（PPP）でキシルロース-5-P（X5P）に代謝されるイソメラーゼ経路38、栄養を供給するワインベルグ経路など、3つのキシロース代謝経路がこの基質からのムコン酸塩の生成を可能にすると考えられています36。キシロースはα-ケトグルタル酸38,39を介してTCA回路に伝達され、ダームス経路40はワインベルグ経路と最初の3つのステップを共有し、その後、α-ケトグルタル酸セミアルデヒドがアルドラーゼによってピルビン酸とグリコールアルデヒドに変換されます。これらの中でも、キシロースが d-キシロースイソメラーゼ (xylA) およびキシルロキナーゼ (xylB) を介してキシルロース-5-リン酸 (X5P) に代謝される d-キシロースイソメラーゼ経路は、理論上の高いムコン酸収量を達成するのに理想的です。 X5P はさらに E4P に変換され、その後シキミ酸経路に入る可能性があるため (図 1a)35。私たちは、E. coli d-キシロースイソメラーゼ (xylA)、キシルロキナーゼ (xylB)、および d-キシロース:H+ シンポーターのコドン最適化バージョンを過剰発現することにより、グルコースからムコン酸を生成するように事前に操作された株 CJ5223 にイソメラーゼ経路を統合しました。 (xylE) をトランスアルドラーゼ (tal) およびトランスケトラーゼ (tkt) と組み合わせて、PPP 内の炭素フラックスを改善します (図 1a)35。また、糖代謝に重要な遺伝子の発現を制御する転写調節因子をコードする hexR も削除しました。これは、これがグルコースからムコン酸への変換を改善することを以前に発見していたためです 32。

トンプソンら。 asbF 経路と aroE 経路の両方を採用すると、正味の前駆体の同化とムコン酸塩への代謝産物のフラックスを最大化するのに役立つことが以前に報告されました 25。したがって、生成物阻害が軽減された改変されたコリスミ酸ピルビン酸リアーゼ（ubiC-C22）41が組み込まれ、aroEを介したシキミ酸経路によるムコン酸産生が増強されました（図1a）。我々は以前、エントナー・ドゥドロフ経路、糖新生エンブデン・マイヤーホフ・ペルナス経路、およびペントースリン酸経路の組み合わせであるEDEMPサイクルを破壊するために、冗長なグルコース-6-Pイソメラーゼをコードするpgi-1およびpgi-2を削除していた42。 EDEMPサイクルを破壊する目的は、グルコースでの増殖中にPEPとは独立してピルビン酸を生成するサイクルを防ぐことであり、これにより、ピルビン酸キナーゼをコードする遺伝子が欠失しているにもかかわらず、細胞がムコン酸生成を犠牲にして炭素を増殖に向けることができる可能性がある。 (pykA、pykF) および PEP カルボキシラーゼ (ppc)3。この戦略は、唯一の炭素源としてグルコースからムコン酸を生成する場合には有益であるが、この場合、キシロースが存在する場合、pgi-1 および pgi-2 の欠失により、asbF および aroE 触媒によるムコン酸生合成経路の理論上の最大ムコン酸収量が減少することになる。 PPP 経由で変換されます (図 1b)。

トウモロコシ茎葉加水分解物中のグルコースとキシロースの混合物中のキシロース画分（キシロース/グルコース+キシロース％、モル）が34〜38％の範囲であることを考慮すると（補足図1）、モデリングはpgi-を使用したムコン酸塩の最大理論収量を予測しました。 1 と pgi-2 は、一方または両方が存在する場合よりも低くなるように削除されました (図 1b)。グルコース-6-リン酸イソメラーゼ（pgi-1およびpgi-2によってコードされる）活性がEDEMPサイクルに入るキシロース流入に必要であるという仮説を検証するために、我々は、P.プチダKT2440由来株であるJE322635に基づいて株を構築した。は、d-キシロースイソメラーゼ経路を使用してキシロースを利用するように以前に操作されましたが、それ以外は野生型であり、LC041 (Δpgi-1)、LC345 (Δpgi-2)、LC347 (Δpgi-1 Δpgi-2) 株を生成します。キシロースを含むM9培地でのプレートリーダー培養では、LC347は増殖できませんでしたが、LC041とLC345は両方とも増殖速度の低下と増殖遅延の増加を示しました（補足図2）。 pgi-1 が完全な状態の LC345 は、pgi-2 のみを含む LC041 と比較して、低い増殖速度と長い増殖遅延を示しました。これは、Pgi-1 が Pgi-2 よりも全体のグルコース-6-リン酸イソメラーゼ活性に寄与していないことを示唆しています。 EDEMPサイクルはムコン酸生合成と競合し、ムコン酸収量が減少すると予想されるため、EDEMPサイクルへのキシロース流入を可能にし、最大理論収量を向上させるためにpgi-1を復元し、QP328株を生成しました（図1aおよび表1）。。

QP328株を振盪フラスコ内でグルコースとキシロースの混合物上で培養し、ムコン酸塩への変換を調べた。キシロースイソメラーゼ経路は野生型P.プチダ35において効率的であることが示されているが、QP328のキシロース利用率はグルコースの利用率と比較して非常に低かった(図1c)。グルコースとキシロースは、同じキシロースイソメラーゼ経路を導入すると、シュードモナス・プチダ KT2440 野生型バックグラウンドで同時に利用できるため 35、キシロースの輸送または代謝におけるボトルネックがムコン酸生成株に存在するという仮説を立てました。

QP328 によるキシロース利用を改善するために、唯一の炭素源およびエネルギー源として 10 mM キシロースを補充した M9 培地上での株の連続継代による ALE を実施しました。集団が継代されるにつれて、より高い OD600 値がより迅速に達成されました。 7継代（〜50世代）後、4つの系統すべてがALE開始時の14日と比較して2〜4日で濁りに達し、進化は終了した。 4つの系統の進化した集団をLB寒天プレート上にプレーティングし、各プレート上の3つの分離株を振盪フラスコプレスクリーニング用に選択した(合計12の分離株)。ほとんどの場合、同じ系統からのすべての 3 つが同様の成長とムコン酸産生を示したので、それらはおそらく同じ遺伝子型を表すと想定され、各系統から 1 つだけが保存されました。ただし、系統 1 では、1 つの複製のパフォーマンスが異なるため、2 つの分離株が保存されました (補足図 3)。キシロース利用の改善に寄与する可能性のある変異を特定するために、5 つの分離株すべてのゲノムが配列されました。 5 つの分離株すべてに、キシロース輸送体 xylE に変異がありました (分離株 1、2、3、4、5 については、それぞれ A62V、A62V および A455V、T34I、L214P、S205F)。分離株のうち 4 株 (1、3 ～ 5) には、aroG-D146N を不活化する可能性のある変異がありました (分離株 1、3、4、5 では、それぞれ、フレームシフト +7 bp、フレームシフト +2 bp、M1N および L2H、フレームシフト -16 bp) ) (図2a)。次に、5 つの分離株を振盪フラスコ内でグルコース、キシロース、およびグルコースとキシロースの混合物について評価しました。予想通り、aroG-D146N に変異がある株は生育は良好でしたが、ムコン酸生成量は減少しました。分離株2は、最高のムコン酸収量と最低のバイオマス収量を達成し、QP478と指定されました（補足図4）。 QP478は、プレートリーダーにおいてQP328と比較してキシロース上での増殖が実質的に改善されたことを示し、QP328の増殖は無視できる一方、QP478は72時間でOD600 0.5に達しました（図2b）。

a 5 つの分離株の全ゲノム配列決定によって ALE で特定された変異 (Sankey 図は SankeyMATIC オンラインツールを使用して構築されました)。 b リバースエンジニアリングされた株LC091およびLC100の増殖曲線。比較のために未進化株QP328および進化した株QP478を含む。 μA は絶対増殖速度を表し、ここで示されるすべての μA は 3 つの独立した増殖曲線の平均値です。 c 30 mM キシロースを補充した M9 培地での、QP478 と比較した、リバースエンジニアリングされた株 LC091 および LC100 の振盪フラスコ実験。 LC100 の収量は、両側スチューデント t 検定を使用して LC091 と比較されました (P < 0.0001)。 d 30 mM グルコースおよび 15 mM キシロースを補充した M9 培地上で、リバースエンジニアリングされた株 LC091 および LC100 と進化した株 QP478 を比較する振盪フラスコ実験。 % モル収量は [mM ムコン酸塩/mM (グルコース + キシロース) × 100] として計算され、% 炭素収量は [mM ムコン酸塩 × 6/mM (グルコース × 6 + キシロース × 5) × 100] として計算されました。ここでのエラーバーは、3 つの生物学的複製の標準偏差を表します。ソースデータはソースデータファイルとして提供されます。

QP478 で特定された変異は補足データ 1 にリストされています。これらのうち、キシロースでの増殖の改善に関連している可能性があると我々が仮説を立てた変異には、以下が含まれます: (1) キシローストランスポーター遺伝子 xylE の 2 つのミスセンス変異。アラニン残基がバリンに置換されています。、A62V および A455V。（2）BPROM σ70プロモーター予測プログラム43によって予測された、PP_2569の上流にある推定プロモーターの-35要素の10 bp上流にあるG→A点突然変異（補足図5）。これは代謝産物主要促進因子スーパーファミリーとして注釈が付けられています（ MFS) Uniprot データベースのトランスポーター。 (3) 重複しているように見えるゲノムの PP_5050 から PP_5242 までの 227.8 kB 領域 (図 2a)。

ALE中のキシロースでの増殖の改善につながった変異の寄与を理解するために、我々は、野生型配列を進化した株QP478に個別に復元した株を作成した。 A62V および A455V 変異は xylE で別々に野生型に復元され、それぞれ LC093 および LC078 が生成されました。 PP_2569 のプロモーター領域の G→A 変異が回復し、LC061 が生成されました。プレートリーダー実験では、xylE-A455VまたはxylE-A62Vのいずれかを回復すると、それぞれLC078およびLC093の増殖速度が低下し、増殖遅延が増加しました（補足図6a〜c）。 PPP_2569 の G→A 突然変異の回復により、増殖速度がわずかに低下しました（補足図 6a、b）。振盪フラスコでは、LC093のみがQP478と比較して大幅に低いムコン酸収量を示しました（補足図6f、g、j）が、LC061、LC078、およびLC093の3株すべてがより遅い増殖とムコン酸生成を示しました（補足図6g–j）。これは、プレートリーダー実験の結果と一致しています（補足図6a〜c）。増殖速度の低下および/または増殖遅延の増加によって引き起こされるムコン酸生産性の低下は、これらすべての変異がQP478のキシロースでの細胞増殖の改善に寄与していることを示しました（補足図6）。

また、本発明者らは逆の実験を行い、親株QP328にALE変異を組み込んで、ムコン酸生成の改善に寄与する変異のみを含む合理的に組み換えられた株を得た。まず、3 つの点変異を持つ未進化の QP328 株をリバースエンジニアリングしました。 A62V および A455V XylE 変異を未進化株 QP328 に導入し、LC091 を生成しました。 PPP_2569 の G→A 変異は QP328 と LC091 で操作され、それぞれ LC092 と LC100 を生成しました。株ＬＣ０９１、ＬＣ０９２、およびＬＣ１００を、ＱＰ３２８およびＱＰ４７８とともに、３０ｍＭキシロースを含むＭ９培地を含むプレートリーダーで評価した。興味深いことに、2つのXylE変異を導入すると、LC091のキシロース上での細胞増殖が可能になり（図2b）、キシロース単独およびキシロースとグルコースの混合物上でのQP478と比較して、同等の増殖速度を示しましたが、最終バイオマスが高くなりました（図2b）。 PPP_2569 から QP328 への G→A 変異の導入により、キシロース上での LC092 の細胞増殖も可能になりましたが、その速度は LC091 と比較してはるかに低かった (図 2b)。予想外に、PPP_2569 の G→A 変異を LC091 に導入すると、キシロースと混合基質の両方で LC100 の増殖が減少し、バイオマスが減少しました（図 2b）。

次に、30 mM キシロースを含む M9 培地を含む振盪フラスコで LC091、LC100、および QP478 を評価しました。 LC091は、バイオマス収量（OD600）のほぼ2倍に達しましたが、QP478と比較して低いムコン酸収量を達成しました（図2c）。さらに、LC100は、速度は低いものの、QP478と同等のムコン酸収量に達しました（図2c）。 RT-qPCRは、PPP_2569のG→A変異がPP_2569の発現を増加させることを示しました（補足図7）。また、グルコースとキシロースの混合物を含む M9 培地上で LC091、LC100、および QP478 を評価しました。キシロースのみの結果と一致して、LC091 のムコン酸収率は、混合物での LC100 および QP478 よりも低くなります。 LC100は、グルコースとキシロースを同時に利用し、同等のムコン酸収量に達しましたが、混合物上では依然としてQP478よりもはるかに遅い増殖を示しました（図2d）。これらの株の違いは、PP_5050 – PP_5242 重複領域内の 1 つまたは複数の遺伝子が QP478 の性能向上に重要である可能性を示唆しました。

株LC091とLC100の間の唯一の遺伝的違いは、推定MFSトランスポーターPP_2569のより高い発現をもたらしたプロモーター領域のG→A変異です（補足図5）。 ALEで変異がどのように起こるかを合理化し、PP_2569が代謝にどのような影響を与えるかを調べるために、キシロース上で増殖させたLC091およびLC100を用いて細胞内および細胞外メタボロミクス実験を実施した。対数期初期、対数期中期、対数期後期から選択された代謝産物を分析し（補足図8）、Zスコアを図3aとしてプロットしました。一般に、LC091は細胞内および細胞外の両方でEDEMP経路とTCAサイクルの両方でより多くの代謝産物を蓄積するのに対し、LC100はシキミ酸経路関連代謝産物のより多くの蓄積を示したことが観察されました（図3a）。 LC091に豊富に含まれるシキミ酸経路関連化合物の3つの顕著な例外、すなわちl-チロシン、l-フェニルアラニン、l-トリプトファンがあり、これらはすべてコリスミ酸由来の芳香族アミノ酸です（図3b-d）。緑膿菌では、l-チロシンと l-トリプトファンが天然の DAHP シンターゼである AroF-1 および AroF-244 を強力に阻害する可能性があることが以前に報告されました。したがって、LC100 では LC091 と比較して AroF-1 および AroF-2 の阻害が少ない可能性があると考えられます。フィードバック耐性 DAHP シンターゼ aroGD146N が我々の株で過剰発現されていますが、以前の研究では、ネイティブ DAHP シンターゼ AroF-1 および AroF-2 単独では、aroGD146N の追加過剰発現と比較して、PCA およびフェノールの産生が約 30% 起こることが示されています。それぞれputida45とPseudomonas taiwanensis46。私たちは、LC091と比較してLC100のムコン酸生成が向上しているのは、AroF-1およびAroF-2の阻害が低いためである可能性があると推論しました（図3b〜e）。LC100におけるPEP濃度の低下とDAHPの蓄積の増加は、この解釈を裏付けています（図3a)。

選択した細胞内および細胞外代謝物のヒートマップ。 Z スコアは、細胞内および細胞外代謝物の平均強度を個別に使用して計算され、非接種培地からのタイムゼロコントロールも細胞外代謝物の分析に含まれました。 b – e 対数期後期からの選択された代謝産物の強度。「In」は細胞内を表し、「Ex」は細胞外を表し、「ND」は検出されなかったことを表します。細胞内強度シグナルは 1 mL の細胞培養物からの細胞ペレットを使用して収集され、細胞外強度シグナルは 20 μL の対応する上清を使用して収集されました。 f XylE (PDB ID: 4GBY)48 の構造。ALE 由来の変異位置の残基は緑色でラベルされています。 d-キシロースは黒い球と棒で示されています。 g 30 mM キシロースを補充した M9 培地上での JE3692 と比較した LC111 株の増殖曲線。ソースデータはソースデータファイルとして提供されます。

さらに、さらなる説明は、PP_2569が芳香族アミノ酸を細胞外に輸送できるということである可能性がありますが、これらのアミノ酸の細胞外蓄積は観察されませんでした（図3b-d）。代わりに、LC100ではアントラニル酸の実質的な細胞外蓄積が見られました（図3e）。アントラニル酸は、l-トリプトファンの前駆体であり、すべての芳香族アミノ酸が由来するシキミ酸経路の重要なノードであるコリスミ酸の直接生成物です。コリスミ酸は細胞内で不安定であることが報告されており 47、我々の細胞内メタボロミクスサンプルでは検出されませんでした。現在の結果に基づいて、我々は、PP_2569がアントラニル酸を輸送できる可能性があり、それがl-トリプトファンの細胞内蓄積の減少につながる可能性があると仮定しました（図3d、e）。アントラニル酸の蓄積の増加により、コリスミ酸から他の芳香族アミノ酸へのフラックスも減少し、LC100 株における l-チロシンおよび l-フェニルアラニンの蓄積の減少につながる可能性があります。この有益な ALE 由来の突然変異の機構的基盤を調査するには、さらなる研究が必要です。

これとは別に、XylE の変異のメカニズムを調べるために、分離株 1 ～ 5 の 5 つの変異 (分離株 1、2、3、4、5 についてはそれぞれ A62V、A62V、および A455V、T34I、L214P、S205F) をラベル付けしました。構造 (PDB ID: 4GBY)48 は、変異がすべて膜貫通ドメインに位置していることを強調しています (図 3f)。以前、Jiang ら。 XylE に 2 つの変異 (G58W および L315W) を導入すると、構造変化を通じて 2 つの阻害剤の結合を防止できることを実証しました 49。特に、G58W 部位は A62V と同じ膜貫通ドメイン内にあり、構造内では T34I に近いです。野生型 XylE と QP328 と同様の遺伝的背景を持つ非ムコン酸産生株 LC345 はキシロース上でよく成長したため (補足図 2a)、ALE で発生した XylE の変異は阻害剤によって誘発されるのではないかという仮説を立てました。ムコン酸生成バックグラウンド株から。また、リグノセルロース加水分解物上で増殖し、LC111 を生成することが以前に報告されている JE3692 株に、変異 xylE-A62V および A455V を導入しました。 2 つの株をプレートリーダーでキシロースについて評価しました。 LC111 は、JE3692 と比較して、遅延時間が短縮され、成長速度が向上し、成長が改善されたことを示しました (図 3g)。このわずかな改善は、天然経路からの微量の阻害剤によって引き起こされる可能性があり、これは、xylE-A62V、A455V の導入により、他の非シキミ酸経路関連産物の生産のためのキシロース利用が改善できることも示唆している可能性があります。

227.8 kBの重複は、ゲノムの残りの部分と比較して、PP_5050からPP_5242までの約2倍高い配列決定範囲に基づいて同定されました（図4a）。ただし、Illumina シーケンスのリード長が短いため、シーケンスデータに基づいて重複領域の正確な位置を特定することは困難でした 50,51。したがって、領域外の既知の配列を相同アームとして使用して、QP478 の PP_5050 ～ PP_5242 の元の領域を削除して LC171 を生成し、PP_5084 ～ PP_5242 から重複の一部を削除して LC173 株を生成しました。 M9培地中の30 mMキシロースでは、全領域欠失のあるLC171はより低い増殖速度を示しましたが、部分的欠失のあるLC173は、QP478と比較してわずかに長い増殖ラグと増加した増殖速度を伴って同等の増殖を示しました（図4b）。これらの結果に基づいて、重複は QP478 のパフォーマンスにとって重要であり、潜在的な有益な遺伝子は PP_5050 ～ PP_5083 領域に存在するはずであり、LC173 ではそのまま残されていると結論付けました。したがって、我々は次に、キシロース上での増殖の改善に寄与するこの領域の遺伝子を同定しようと努めた。

a 次世代シーケンシングデータからの重複領域の同定。QP478 の最大 2 倍のシーケンシングリード数と、LC171 および LC173 のこれらの重複領域の完全および部分欠失がそれぞれ示されました。カバレッジのグラフは Geneious Prime 2020.0.4 で生成されました。 b 30 mM キシロースを含む M9 培地上での QP478、LC171、および LC173 の増殖曲線。 λは成長遅れを表し、μAは絶対成長速度を表し、両方とも3つの独立した成長曲線の平均値です。 c リバースエンジニアリングされた株LC100のΔpykF部位における候補遺伝子の過剰発現。 d 30 mM キシロースを含む M9 培地上での QP478、LC100、LC199 および LC224 の増殖曲線。 e パネル d から抽出された最大比増殖速度。 f パネル d から抽出された成長遅延値。 g – i それぞれ、30 mM キシロース、30 mM グルコース + 15 mM キシロース、および 30 mM グルコースを含む M9 培地での LC224 株の振盪フラスコ実験のプロファイル。振盪フラスコ実験の場合、モル収率 % は [mM ムコン酸塩/mM (グルコース + キシロース) × 100] として計算され、炭素収率 % は [mM ムコン酸塩 × 6/mM (グルコース × 6 + キシロース × 5) × 100] として計算されました。 ]。ここでのエラーバーは、3 つの生物学的複製の標準偏差を表します。ソースデータはソースデータファイルとして提供されます。

LC100ではグルコースとキシロースはどちらも同様に低い速度で利用されていたため（図2d）、我々は、成長の遅さは両方の糖が共有する経路の一部で現れるのではないかと推論しました。 PP_5050 ～ PP_5083 内の 3 つの候補遺伝子が、LC100 での過剰発現のために選択されました。その中には糖代謝に関連する 1 つ、PP_5056 (gpmI、2,3-ビスホスホグリセリン酸非依存性ホスホグリセリン酸ムターゼ)、およびシキミ酸経路の 2 つ、PP_5078 (aroB、3-デヒドロキネート) が含まれます。シンターゼ）およびPP_5079（aroK、シキミ酸キナーゼ）（図4c）。 PP_5085 (maeB、リンゴ酸酵素 B) および PP_5150 (rpiA、リボース-5-リン酸イソメラーゼ A) など、この領域外にあるが糖代謝に関連する他の 2 つの遺伝子もテストされました。次に、5 つの遺伝子の過剰発現カセットを ΔpykF 部位に個別に挿入し、LC147 (gpmI)、LC150 (maeB)、LC151 (rpiA)、LC199 (aroK)、および LC224 (aroB) 株を生成しました。これらの遺伝子はすべて、gpmI を除いて、Ptac プロモーターによって駆動されました。gpmI は、Ptac を使用してゲノムに遺伝子を挿入する試みが 2 回失敗した後、Plac プロモーターによって駆動されました。次に、得られた株を、M9培地および30 mMキシロースを含むプレートリーダーでLC100およびQP478を使用して評価しました（図4d〜f）。 LC100の糖代謝に関連する3つの遺伝子の過剰発現は成長遅延を軽減しませんでしたが、LC150およびLC151株はより高い成長速度とより大きな最終バイオマス蓄積を示しました（補足図9）。 LC091株で観察されたように（図2b〜d）、バイオマス収量が高くなるとムコン酸収量が減少する可能性があることを考慮して、これらの目標をこれ以上追求しないことにしました。それぞれ aroK と aroB を過剰発現する LC199 株と LC224 株は、両方とも LC100 と比較して増殖速度の向上と増殖遅延の減少を示しました（図 4d–f）。 LC224 は QP478 よりもさらに速く成長し、同様の遅延時間とより高い成長率を示しました（図 4d–f）。

aroK と aroB の過剰発現の潜在的な相加効果を調べるために、LC100 で aroKB としてオペロン様パターンで aroK と aroB を発現させ、LC168 株を生成しました。株 LC199、LC224、LC168、および QP478 を、ムコン酸生成を調べるために、グルコースおよびキシロースを含む M9 培地を用いた振盪フラスコ実験で評価しました。 aroB過剰発現株LC224は、より高いムコン酸収量と改善された増殖速度で進化した対応物QP478を上回り（補足図10a、c）、DAHPの3-デヒドロキネート（3DHQ）への反応がLC100における律速であることを示唆しています。 LC100でaroKを過剰発現させると（LC199が生成される）、増殖速度がわずかに増加しました（補足図10b、d）。株ＬＣ１６８は、ＬＣ２２４と比較して改善を示さなかった（補足図１０ｃ、ｅ）。

aroB の過剰発現だけで株の性能が向上するかどうかを調べるために、QP328 で aroB を過剰発現させ、LC349 株を生成しました。 LC349、QP328、およびLC224株のプレートリーダー評価では、LC349はLC224と比較してグルコース上で最も高い増殖速度を示し、グルコースとキシロースの混合物上ではわずかに低い増殖速度を示しましたが、驚くべきことではありませんが、LC224と比較してキシロース上でははるかに遅い増殖でした（補足図） .11a–c)、おそらく xylE に変異がないためです。興味深いことに、グルコースとキシロースの混合物に関する振盪フラスコ実験では、LC349ははるかに高いムコン酸収率でQP328を上回りましたが、それでもLC224よりも大幅に低かった（補足図11d–f）。最大ムコン酸力価に達するまでにLC349では最大41時間、LC224では26.5時間かかったため、LC349のムコン酸生成はLC224よりも遅い（補足図11e、f）。

次に、グルコース、キシロース、またはその 2 つの混合物を含む M9 培地での LC224 の性能を調べました。ムコン酸塩の収量は、キシロースで最も高く、グルコースで最も低く、混合物で中間でした（図4g-i）。これは、E4Pを供給するためにペントースリン酸経路にキシロースを導入する利点を反映しています。興味深いことに、グルコースとキシロースの両方の利用率は、グルコースまたはキシロース単独の場合と比較して、グルコースとキシロースの混合物の方が高かった（図4g-i）。

LC224およびQP478のバイオリアクター培養は、糖（グルコースおよびキシロース）濃度を10 g L-1未満に維持するために流加モードで実施されました（補足図12a〜c）。グルコースとキシロースは、培養開始時から両方の株で同時に利用されました（図5a、b）。ただし、糖利用率は QP478 よりも LC224 の方が高かった。 LC224は培養終了までに46 g L-1のグルコースと20 g L-1のキシロースを利用したが、QP478はそれぞれ34 g L-1と10 g L-1を利用した。ムコン酸力価は、QP478と比較してLC224でほぼ3倍高く、それぞれ26.8 g L-1および9.3 g L-1でした（図5a、b）。ムコン酸塩の収率は、LC224では50％（モル収率）に達しましたが、QP478では収率が25.9％でした（図5a、b）。 LC224におけるこれらの改善は、全体のムコン酸生成速度（0.28 g L-1 h-1）にも反映されており、QP478で達成された速度（0.10 g L-1 h-1）よりも大幅に高かった（図5a、b）。

a、b 96.6時間培養におけるQP478およびLC224からの細菌増殖、グルコースおよびキシロース利用、およびムコン酸力価、収量、および速度。 c 191時間培養におけるLC224からの細菌増殖、グルコースおよびキシロース利用、ムコン酸力価、収量、および比率。 a および b について、データポイントは生物学的重複の平均値を表し、エラーバーは各時点で重複から生成されたデータ間の絶対差を表します。 (c) の場合、データ点は一重項の値を表します。各時点での代謝収率（モル％）は、生成されたムコン酸塩の量（モル）を利用したグルコースおよびキシロース（モル）で割ったものとして計算した。代謝収率 (mol%) は、塩基および基質の供給量によって生成される希釈係数に基づいて補正されます。記載されている最終炭素収量（炭素％）は、[mM ムコン酸塩 × 6/mM (グルコース × 6 + キシロース × 5) × 100] として計算されました。各時点での速度（g L-1 h-1）は、ムコン酸濃度を培養時間で割ったものとして計算されました。記載されているすべての力価 (T)、速度 (R)、および収量 (Y) の値は最後の時点のものです。 (c) にリストされている最終収率 (mol%、炭素%) も、定量化された蒸発量に基づいて補正されています。ソースデータはソースデータファイルとして提供されます。

バイオリアクター培養で達成されたムコン酸の力価、速度、および収量は、96.6時間で、それぞれ26.8 g L-1、0.28 g L-1 h-1、および49.9％でした（図5b）。この収量は、我々の株設計および代謝モデリングに基づいた理論上の最大値のほぼ 100% に相当します (上記の図)。力価をさらに改善できるかどうかを調べるために、LC224を191時間培養する別のバイオリアクター実験を実施しました（図5c）。得られたムコン酸力価は 33.7 g L-1 に増加し、収率は 46%、蒸発を補正すると理論的最大値の 92% となりました。また、LC224 が約 54 時間で定常期に達したが、細胞が糖を利用してムコン酸を生成し続けたことも注目に値します。これは、ここでのムコン酸の生成が増殖と連動していないことを示しており、実験を行うとムコン酸の力価と収量がさらに向上する可能性があることを示唆しています。継続していました（図5b、c）。

進化していない親株 QP328、進化した株 QP478、および合理的に操作された株 LC224 の違いをより深く理解するために、細胞内および細胞外のメタボロミクス実験が実施されました。糖代謝とムコン酸生成に関連する選択された代謝産物を図6に示します。QP328と比較して、QP478およびLC224株はEDEMPサイクルにおける代謝産物の蓄積の減少、シキミ酸経路およびムコン酸経路における代謝産物のより大きな蓄積を示しました（図6）。これは、QP478 で進化し、LC224 で操作された突然変異と一致します (図 2 および 4)。しかし、糖代謝とシキミ酸経路の結合ノードであるDAHPの強度は、シキミ酸経路の他の代謝産物と比較して逆のパターンを示しました（図6b）。 LC224 および QP478 は、QP328 と比較して DAHP の蓄積が少なく、これは重複および aroB 過剰発現に関する上記の目的と一致しています。

簡略化された代謝経路。 EDEMP サイクルの代謝物は青色、シキミ酸およびムコン酸経路の代謝物は緑色、関節節 DAHP は紫色、細胞外アントラニル酸 (ANA) は茶色でラベルされています。 QA キナ酸、ANA アントラニル酸。 b 3 つの株 QP328 (青)、QP478 (オレンジ)、および LC224 (赤) における選択された代謝産物の強度。細胞内強度は凍結乾燥バイオマスによって正規化されています。エラーバーは、3 つの生物学的複製の標準偏差を表します。ソースデータはソースデータファイルとして提供されます。

具体的には、LC224のDAHPレベルはQP478と比較してはるかに低く、これはtacプロモーターによって駆動されるLC224のaroB活性がQP478の活性よりも高かったことを示唆している可能性がある。 DAHPを除いて、LC224はQP478と比較してシキミ酸経路でより多くの代謝産物を蓄積し、EDEMPサイクルでより少ない代謝産物を蓄積しました（図6a、b）。これは、LC224のシキミ酸経路に入るより多くのフラックスが示唆され、より多くのムコン酸生合成が可能になることを示唆しています。

その前駆体である3DHQはどのサンプルからも検出されませんでしたが、キナ酸（キナ酸、QA）はLC224に実質的に蓄積されており（図6b）、これはaroBの過剰発現に起因する炭素のオーバーフローを示唆している可能性があります。 LC224におけるシキミ酸（シキミ酸、SA）の蓄積は、aroE経路を介したムコン酸生合成の証拠であるが、SA蓄積はLC224と比較してQP478ではるかに低く、これはQP478におけるaroK重複に関連している可能性がある。培地中のアントラニル酸の蓄積は、オーバーフロー代謝の別のケースを示している可能性があります。より多くのカテコール（CAT）がLC224に蓄積され（図6b）、これはムコン酸へのフラックスの増加に関連する新たなボトルネックを表す可能性があります。まとめると、これらの結果は、LC224 を生成するための操作が進化した株 QP478 を広範に再現していることを示しており、さらなる改良のための追加のターゲットを示唆しています。

既存の石油化学製品に取って代わるためには、持続可能なバイオベースの化学品を生産する技術が必要です。この取り組みにとって重要なのは、グルコースやキシロースなどのリグノセルロース糖を工業的に適切な力価、速度、収量で製品に変換する菌株の操作です。この研究では、グルコースとキシロースの混合物からのムコン酸塩の理論上の最大モル収率は、混合物中のキシロース含量が 33 ～ 40% (mol%) の場合、グルコースのみの場合の約 40% から 50% まで増加しました。リグノセルロース加水分解物の関連比率（図1b、補足図1）。これは、E4P を供給する d-キシロースイソメラーゼ経路を導入し、EDEMP サイクルを可能にする pgi-1 を再導入することによって達成されました。 ALEを使用して株を操作するための追加のターゲットを特定すると、最終的にグルコースとキシロースの混合物で46％の収率を達成しました（図5c）。これは、グルコースのみを変換するように操作された株で以前に達成した35.6％を大幅に上回っています32。

ALE中に、選択されたすべての分離株でxylEの変異が発生し（図2aおよび3f）、キシロースでの増殖が改善されました。 5つの突然変異はすべて、トランスポーターの膜貫通ドメインにあります（図3f）。同じシステムでの以前の研究 35 と、キシロース代謝はムコン酸生成株 QP328 (図 1c および 2b) では阻害されたが、非ムコン酸生成類似体 LC345 (補足図 2a) では阻害されなかったことを示す我々自身のデータに基づいて、我々は、この変異はムコン酸を産生するバックグラウンド株からの阻害剤に対する反応であったと考えています。今後の研究では、潜在的な阻害剤を特定し特徴付けるためのさらなる研究が進められる予定です。さらに、プロモーター領域のG→A点突然変異によって可能になった推定MFSトランスポーターであるPP_2569の発現増加により、LC100におけるムコン酸収量が大幅に増加し、バイオマス収量が低下しました（図2b、c）。メタボロミクス分析は、 EDEMPサイクルからシキミ酸経路への代謝フラックスのリダイレクト（図3a）。キシロース上で増殖させたLC091株およびLC100株の細胞内および細胞外メタボロミクス分析により、PP_2569がアントラニル酸を輸送し、それによって天然のDAHPシンターゼを阻害することが知られている芳香族アミノ酸の細胞内蓄積を減少させることができる可能性が示唆された。また、未進化の株QP328と比較して、QP478株およびLC224株の細胞外アントラニル酸の強度がより高いことも観察されました（図6b）。 PP_2569 による機構の研究は、さらなる工学に役立つ可能性があります。

ALE では、PP_5050 ～ PP_5242 のゲノム領域の重複も生じました。この領域内で、我々は、LC224においてキシロース上で高い増殖速度に達するには、aroBの過剰発現が必要であることを実証した。 CJ5223のhexRを欠失させることでグルコースからムコン酸への変換を改善するように以前に操作された株GB062株では、トランスクリプトミクスにより、hexR32の欠失によりaroBの発現がすでに増加していることが示された。グルコースから PCA を生成するように P. putida を操作した別の研究では、aroB の過剰発現は生成の改善に寄与しませんでした 45。ただし、グルコースとキシロースの混合物で培養したLC100株では、LC224でのaroBの過剰発現により成長とムコン酸生成が改善されたため、AroB活性が律速になっているようです（図4d–iおよび補足図10b、c）。これは、キシロースが非酸化的ペントース経路に入ることで、E4Pの供給が強化され、E4PとPEPのDAHPへの縮合を介してシキミ酸経路への炭素の流入が増加したことを示している可能性がある。 DAHP のレベルが向上したことで、AroB によって触媒される次の反応が起こり、以前にはなかった律速が起こりました。全体として、シキミ酸経路への、およびシキミ酸経路を通る炭素の流れを改善するためにここで示した工学戦略は、P.プチダにおけるグルコースおよびキシロースからの他のシキミ酸由来生成物の生産を改善するために活用できる可能性がある。

私たちの合理的に操作された株LC224は、キシロース上での増殖において進化した株QP478を上回りました（図4d）。潜在的な理由の 1 つは、QP478 における大規模な重複の冗長性、複雑さ、負担である可能性があります。このような重複は、特定の領域の重複が優先または制限されるように、ゲノム内の 2 つ以上の位置にある類似した配列内での組換えによって可能になる可能性が高く、最終的には実験室の時間スケール内で理想的な結果に到達する進化の能力を制限します。ただし、ゲノム工学を使用すると、正確な変更を加えることができます。実際、LC224におけるaroB単独の過剰発現は、PP_5050-PP_5242の重複全体を含むQP478を上回りました（図4d〜fおよび補足図10a、c）。これは、合理的エンジニアリングのターゲットを特定するツールとしての ALE の有用性と威力を示しています。

aroB の過剰発現により、LC100 と比較して LC224 の糖利用が大幅に改善されました (図 2d および 4h)。メタボロミクス解析では、LC224 の細胞内 DAHP レベルは他の 2 株よりも低いことがわかりました (図 6)。これは、DAHP の蓄積が糖代謝に悪影響を及ぼし、aroB の過剰発現によって軽減できることを示唆している可能性があります。さらに、QP328でのaroB単独の過剰発現によりLC349が生成されると、グルコースとキシロースの混合物ではLC224と比較してムコン酸収量がわずかに低下しました（補足図11d–f）。 QP478 株の PPP_2569 の G→A 変異の復元には、ムコン酸収量の変化という点で LC091 のリバースエンジニアリングに匹敵する効果がなかったため (図 2c および補足図 6g、h)、これらの結果を総合すると、aroB がPP_2569 の過剰発現 (重複による) とアップレギュレーションは、DAHP シンターゼのフィードバック阻害の軽減に同様の効果をもたらし、ムコン酸生合成経路への流入の改善につながりました。

当社の操作株のメタボローム解析は、LC224 でここで実証したことを超えて、ムコン酸生産をさらに改善するための将来の工学的取り組みについての初期の洞察を提供し、将来の研究で追求されます。この株によるキネートの蓄積（図6b）は、aroQの過剰発現またはquiAの欠失によってその性能を改善するアプローチを示唆している可能性があります。シキミ酸の蓄積に関しては、aroBおよびaroKの過剰発現は、aroBのみを過剰発現する同等の株であるLC224と比較してLC168の性能を改善しませんでした（図4hおよび補足図10c、e）。これは、特にQP478によって蓄積される比較的高レベルの細胞外アントラニル酸（ANA）を考慮すると、経路の下流ステップにおける潜在的なボトルネックを示唆している可能性があります（図6b）。コリスミ酸 (CSA) から 4-ヒドロキシ安息香酸 (4HB) への変換が不十分であることが、アントラニル酸蓄積の原因の 1 つである可能性があります。コリスミ酸ピルビン酸リアーゼをコードする遺伝子 ubiC-C22 は、産物の阻害を軽減するように以前に操作されており、我々の株では比較的弱い lac プロモーターによって駆動されており、LC224 のシキミ酸を介してムコン酸生合成を促進する潜在的なアプローチは、aroK を過剰発現することである可能性があります。同時にubiC-C22の発現レベルを増加させます。

以前に実施されたグルコース、グルコースおよびペントース糖の変換に関する技術経済分析 3 では、ムコン酸塩の最低販売価格 (MSP) が収量と率の増加に伴って大幅に低下することが示されました。我々の操作された菌株 GB271 は、グルコースから 36% の収率および 0.21 g L-1 h-1 の速度でムコン酸塩を生成しました。これは、このモデルによると約 3 kg-1 ドルの MSP に相当します 32。ここで、LC224は0.28 g L-1 h-1でほぼ50％の収率を達成しました（図5b）。これにより、MSP は約 2.2 kg-1 に減少します。これは、以前に商業的に実行可能であると予測されていた 1.96 ドルの MSP に近い値です 3。このモデルは、レートと収量を増加させることで MSP をさらに削減できることを示唆しています。我々の菌株設計ではモル収率 50% が既に理論上の最大値に達していることを考慮すると、さらなる速度の増加が MSP 改善の鍵となります。

結論として、この研究は、P. putida を使用してグルコースとキシロースからムコン酸を生成する効果的な戦略を示しています。グルコースとキシロースからのムコン酸の有望な収量と力価を考慮すると、我々の株 LC224 は、他のシキミ酸経路由来化合物の生産のための有望なプラットフォーム株となる可能性もあります。

Q5® High-Fidelity 2X Master Mix (New England Biolabs) をすべてのポリメラーゼ連鎖反応に使用し、必要に応じて DpnI (New England Biolabs) 消化して細胞由来のプラスミドテンプレートを除去しました。 NEBuilder HiFi Assembly Master Mix (New England Biolabs) をプラスミド構築に使用し、続いて化学的にコンピテントな NEB 5-α F'Iq E. coli (New England Biolabs)、または CopyCutter™ EPI400™ エレクトロコンピテント E. coli に形質転換して、プラスミド収量はすべて製造元の指示に従っています。形質転換体を、50 μg mL-1 カナマイシン (Sigma-Aldrich) を補充した溶原性ブロス (LB) 寒天 (Lennox) プレート上で選択し、37 °C で一晩増殖させました。正しい構築物がサンガー配列決定法（GENEWIZ, Inc.）によって確認された。いくつかのプラスミドを合成した(Twist Bioscience)。詳細なプラスミド構築情報は補足データ 2 に記載されています。合成されたプラスミドの配列は補足データ 3 にあります。プラスミド構築に使用されるオリゴは補足データ 4 にリストされています。

遺伝子の欠失、挿入、置換は、染色体へのプラスミドの第 1 ラウンドの相同組換えの選択マーカーとしてカナマイシン耐性遺伝子 nptII を使用し、第 2 ラウンドの相同組換えの対抗選択マーカーとしてスクロース感受性遺伝子 sacB を使用して実行されました。染色体外での組換え52。 MyTaqTM Red Mix (Bioline) を使用して、生成物サイズまたは存在の違いに基づいて診断用コロニー PCR 生成物によって、正しい遺伝子欠失、挿入、および置換を同定しました。点突然変異の挿入および修復については、3' ヌクレオチドが突然変異ヌクレオチドにアニールするプライマーを使用してコロニー PCR 産物のバンドの強度を比較することによって正しい置換をスクリーニングし、続いてサンガー配列決定で確認しました。

エレクトロポレーションまたはコンジュゲーションのいずれかを介して、プラスミドをシュードモナス・プチダに形質転換した。エレクトロポレーションでは、P.プチダ株をグリセロールストックからLB培地に接種し、30℃、225rpmで一晩培養しました。エレクトロコンピテント細胞は、2.5 mL の一晩培養物を遠心分離し、300 mM スクロースで 3 回洗浄し、続いて細胞を 50 μL 300 mM スクロースに再懸濁することによって調製しました53。エレクトロポレーション用のプラスミドは、バックボーンプラスミドpK18sB54を使用して構築し、Gene Pulser Xcell (Bio-Rad)を1.6 kV、25 μF、200オームの設定で使用して0.1 cmキュベット内でエレクトロポレーションしました。全プロセスは室温で実行されました。結合のために、R4P oriTを含むバックボーンプラスミドpK18msBに基づいてプラスミドを構築し、ドナー大腸菌S17-1細胞55からレシピエントP.プチダ株に移入した。プラスミドを含むドナー大腸菌 S17-1 株を、50 μg mL-1 カナマイシンを補充した LB 培地に植菌し、37 °C、225 rpm の振盪インキュベーターで一晩培養しました。レシピエントのP.プチダ株をLB培地に接種し、振盪インキュベーター内で30℃、225rpmで一晩培養した。続いて、1 mL の一晩ドナー細胞とレシピエント細胞を 5000 xg で 2 分間遠心分離し、LB 培地で 2 回洗浄した後、ペレットを再懸濁し、それぞれ 400 μL を 1 本の微量遠心管で混合し、再度遠心分離しました。混合ペレットを 50 μL LB 培地を使用して再懸濁し、低濃度の 2 つの抗生物質を含む LB プレートに滴下しました。大腸菌 S17-1 の細胞増殖を阻害するための 10 μg mL-1 クロラムフェニコールと、大腸菌 S17-1 の細胞増殖を阻害するための 5 μg mL-1 カナマイシンです。 P.プチダの細胞増殖。プレートを 30 °C で 6 ～ 10 時間インキュベートして結合させた後、細胞を同じプレート上に単一コロニーとして画線し、30 °C で一晩インキュベートしました。低濃度の抗生物質を含むLBプレート上の単一コロニーを、接合接合体を選択するために、P.プチダが本来耐性である100μg mL-1のクロラムフェニコールおよび50μg mL-1のカナマイシンを含む新しいLBプレートに再画線培養した。この研究で使用されたすべての株は表1に記載されており、詳細な株構築情報は補足データ5に記載されています。

For shake flask and growth curve experiments, seed cultures were inoculated from glycerol stocks into 14-mL round bottom Falcon® tubes containing 5 mL of LB Miller medium and incubated overnight at 30 °C and 225 rpm. Overnight cultures were then inoculated into a 125-mL baffled shake flask containing 10 mL LB medium to an initial OD600 of 0.2. These second seed cultures were cultivated at 30 °C at 225 rpm for 4 h to reach an OD600 of ~2. The second seed cultures were washed twice with M9 salts (6.78 g L−1 Na2HPO4, 3 g L−1 KH2PO4, 0.5 g L−1 NaCl, 1 g L−1 NH4Cl) and then inoculated into a 125-mL baffled shake flask containing 25 mL modified M9 minimal medium (6.78 g L−1 Na2HPO4, 3 g L−1 KH2PO4, 0.5 g L−1 NaCl, 1 g L−1 NH4Cl, 2 mM MgSO4, 100 µM CaCl2, 18 µM FeSO4) supplemented with either 30 mM xylose, 30 mM glucose, or mixture of 30 mM glucose and 15 mM xylose, to an initial OD600 of 0.1. The molar ratio of glucose and xylose in mixed substrates is 2:1, which is the ratio typical of corn stover hydrolysates10% v/v) during fermentation without hydrolysate purification or concentration. Energy Environ. Sci. 9, 1237–1245 (2016)." href="/articles/s41467-022-32296-y#ref-CR56" id="ref-link-section-d4408857e3149"> 56. すべての増殖曲線は、上記の振盪フラスコについて説明したように接種された 300 μL 培養物を使用して、Bioscreen C Pro アナライザー (Growth Curves US) で特性評価されました。振盪フラスコおよびプレートリーダーのデータは、GraphPad Prism バージョン 8.4.2 を使用してプロットおよび分析されました。絶対成長速度 (μA) と成長遅れ (λ) は、GitHub (https://github.com/scott-saunders/growth_curve_fitting) に寄託された FittR ツールのデフォルト設定を使用して、ゴンペルツ方程式に基づいて計算されました。場合によっては、モデルに適合させるために死亡期が成長曲線から削除されました。

ミニ pH メーター (HORIBA LAQUAtwin pH-33) を使用して各サンプリング時点でフラスコの pH 値を監視し、必要に応じて 1 N NaOH を使用して pH を 7 に調整しました。振盪フラスコ実験の場合、収率を計算しました。最大ムコン酸濃度が検出された時点。

図1aに示す反応を考慮したP. putida3のコア炭素代謝モデルは、P. putida KT244058のゲノムスケールモデルから適応された化学量論を使用して、aroE合成経路からの反応で拡張されました。収量の計算は、培地中のキシロース画分を変化させながらムコン酸フラックスを最適化することにより、ATP 維持の必要性がないと仮定して実行されました。計算は、Python 3.8.1059 の cobrapy ライブラリ (バージョン 0.22.1) を使用して実行されました。

ALEを実施するために、QP328株をまずグリセロールストックからLBミラー培地に接種し、種培養物として一晩増殖させた。次いで、一晩培養した細胞をＭ９塩で２回洗浄し、Ｍ９塩に再懸濁した。洗浄した細胞を、唯一の炭素源として 10 mM キシロースを含む 5 mL の M9 培地を含む培養チューブに初期 OD600 0.1 になるまで接種し、225 rpm で振盪しながら 30 °C で培養しました。連続継代は、増殖が観察されたときに培養液の 1% (v/v) を新鮮な培地に移すことによって実行され、最初は最大約 2 週間の培養を要しました。世代数は、OD600 値に基づいて式 (1) に従って計算されました。 (1):32

初期集団、定期的な中間集団、および最終集団はグリセロールストックとして保存されました。

シス,シス-およびシス,トランス-ムコン酸異性体は、両方のムコン酸異性体の正確な定量を達成するためにシス,トランス-ムコン酸の独自の標準を調製することによって分析されました60。分離と検出は、次のクロマトグラフィー条件を使用して達成されました。サンプルと標準は、ダイオードアレイ検出器 (DAD) と Phenomenex Luna C18(2)-HST カラム 2.5 μm、2 × 100 mm カラムを組み合わせた Agilent 1290 シリーズ UHPLC (Agilent Technologies) を使用して分析しました。温度を 45 °C に一定に保ったカラムに 1 μL の注入量を注入しました。ムコン酸異性体は、波長 265 nm で 1 ppm ～ 500 ppm の定量範囲でモニタリングおよび定量されました。 0.16% ギ酸水溶液 (A) とアセトニトリル (B) の勾配を 0.5 mL min-1 の流速で利用しました。分析物のクロマトグラフィーによる分離は、次の勾配プログラムを使用して達成されました。初期 (t0) から t = 1 分: A-100% および B-0%。 t = 1 ～ 7.67 分で A-50% および B-50% にランプします。 t = 7.67 ～ 9.33 分で A-30% および B-70% まで上昇し、10.67 分まで維持されます。 10.68 分で、勾配を A-100% および B-0% に戻し、合計実行時間 13 分間均一濃度を維持しました。検出器の安定性を確保するために、10 ～ 15 サンプルごとに校正検証標準を実行しました。グルコースは、Aminex HPX-87H カラム (Bio-Rad)61 と組み合わせた屈折率検出を備えた HPLC によって定量され、キシロースも同様に同時に定量されました。純粋な標準は Sigma-Aldrich から購入しました。

LC091株およびLC100株におけるPP_2569の定量的逆転写PCR(RT-qPCR)のために、上記の振盪フラスコプロトコールに従って、M9および30mMキシロースを含む振盪フラスコ中で細胞を培養した。株LC100およびLC224におけるPP_4302のRT-qPCRのために、細胞をLB培地を含む振盪フラスコ中で培養した。対数増殖期中期に細胞を回収し、TRI® 試薬 (Sigma、T9424) を使用して細胞を破壊し、続いてプロトコールに従って Direct-zolTM RNA ミニプレップキット (Zymo Research、R2052) を使用して RNA ミニプレップを行いました。次に、抽出された全 RNA を DNase I (Zymo Research、E1009-A) を使用して消化し、RNA Clean & ConcentratorTM-5 キット (Zymo Research、R1014) を使用して精製しました。 NanoDropTM one (Thermo Scientific) を使用して 260 nm で RNA 濃度を測定し、iScriptTM Reverse Transcription Supermix (Bio-Rad) を使用して逆転写のために各サンプルの合計 RNA 500 ng を添加し、cDNA を合成しました。 RT-qPCR は、KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix (Sigma-Aldrich) と 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems) を使用して実施しました。

ハウスキーピング遺伝子 rpoD を参照コントロールとして使用して、さまざまなサンプルを正規化しました 62。 rpoD の増幅にはプライマー oLC-0109 および oLC-0110 を使用しました。 oLC-0107およびoLC-0108はPP_2569の増幅に使用されました。 oLC-0353およびoLC-0354はPP_4302の増幅に使用されました。我々は 2-ΔΔCt 法を使用してサンプル間の転写レベルを定量しました 63。

バイオリアクターで株 QP478 および LC224 を評価するために、50 mL の LB (Miller) を含む 250 mL バッフル付きフラスコ内のグリセロールストックから株を接種し、30 °C および 225 rpm で 16 時間インキュベートしました。種子培養は各菌株について二重に実施し、各複製を利用して独立したバイオリアクターに接種しました。細胞を遠心分離し（５０００×ｇ、１０分間）、上清を廃棄し、細胞を５ｍＬの修飾Ｍ９に再懸濁した。改変された M9 には、13.56 g L-1 Na2HPO4、6 g L-1 KH2PO4、1 g L-1 NaCl、2 g L-1 (NH4)2SO4、2 mM MgSO4、100 μM CaCl2、および 36 μM FeSO4 が含まれていました。

Cells were inoculated in 0.5 L bioreactors (BioStat-Q Plus, Sartorius Stedim Biotech) at an initial OD600 of 0.2. The batch phase consisted of growth on 300 mL of modified M9 with 10.6 g L−1 glucose and 4.4 g L−1 xylose, which mimics the sugar ratio in sugar hydrolysates from corn stover10% v/v) during fermentation without hydrolysate purification or concentration. Energy Environ. Sci. 9, 1237–1245 (2016)." href="/articles/s41467-022-32296-y#ref-CR56" id="ref-link-section-d4408857e3452"> 56. 流加フェーズは、糖濃度が約 7 g L-1 になったときに開始され、この時点で供給速度を手動で変更することにより、糖濃度を約 2 ～ 10 g L-1 に維持するように砂糖を供給しました。供給溶液は３５３ｇＬ−１のグルコースおよび１４７ｇＬ−１のキシロースを含有し、そのｐＨはＮａＯＨでｐＨ７に調整された。バイオリアクターは、30 °C で 4 N NH4OH を添加して pH 7 に制御し、空気を 1 vvm でスパージしました。バッチ段階における初期撹拌速度は３５０ｒｐｍであった。溶存酸素 (DO) が 30% の値に達すると、自動撹拌調整によって自動的にそのレベルに制御されました。細菌の増殖を評価し、糖濃度とムコン酸を分析するためにサンプルを定期的に採取しました。

グルコースとキシロースの混合物上で対数増殖期中期（OD600 ~1.0）で増殖させた振盪フラスコ培養物 1 mL を遠心分離することによって、細胞ペレットと上清サンプルを別々に収集し、サンプルを分析するまで -80 °C で凍結しました。。細胞ペレットを凍結乾燥し、クロロホルム/メタノール/水64の溶媒混合物を使用して3 mgの乾燥バイオマスから細胞内代謝産物を抽出し、水層と有機層の両方を新しいバイアルに移し、完全に乾燥させました。細胞外代謝産物は、分析前に上清サンプルを真空下で乾燥させることによって調製されました。代謝産物は以下の方法に基づいて化学的に誘導体化されました65。カルボニル基を保護し、互変異性体の形成を減らすために、メトキシアミンの溶液 (ピリジン中の 30 mg mL-1 ストックの 20 μL) を各乾燥抽出物に添加しました。次に、サンプルを振盪しながら 37 °C で 90 分間インキュベートしました。ヒドロキシル基、アミノ基、カルボキシル基の酸性プロトンを除去するために、トリメチルシリル化反応を使用しました。具体的には、1% トリメチルクロロシランを含む N-メチル-N-(トリメチルシリル) トリフルオロアセトアミド (80 μL) を各バイアルに加えました。サンプルを再び 37 °C で 30 分間継続的に振盪しながらインキュベートしました。インキュベーションが完了した後、バイアルを遠心分離し、液体を少量のガラスインサートに移しました。サンプルは、非ターゲット分析用の HP-5MS カラム (30 m × 0.25 mm × 0.25 μm; Agilent Technologies) を使用したガスクロマトグラフィー質量分析計 (GC-MS) によって分析されました。各サンプルに 1 µL の量をスプリットレスモードで注入し、重水素化ミリスチン酸の溶出時間に基づいた保持時間ロック機能を使用してヘリウムガス流量を確立しました (Agilent Technologies、カリフォルニア州サンタクララ)。分析中、注入ポートの温度は 250 °C に維持されました。 GC オーブンの勾配は、注入後 1 分間保持した 60 °C の温度から始まり、続いて 10 °C min-1 の速度で 325 °C まで上昇し、325 °C で 10 分間保持して終了しました。 MS データの収集は、50 ～ 600 m/z の質量範囲をカバーしました。脂肪酸メチルエステル (FAME、C8 ～ C28) の混合物をサンプルのすべてのバッチと並行して分析し、その後のデータ分析で保持指数の調整を実行できるようにしました。 GC-MS データファイルは CDF 形式に変換され、ソフトウェア Metabolite Detector 2.566 を使用してデコンボリューションおよびアライメントが行われました。代謝産物の同定は、Fiehn データベースの拡張バージョンである PNNL メタボロミクスデータベースと照合することによって行われました 67。このデータベースには、1,000 を超える本物の化学標準の質量スペクトルと保持指数情報が含まれており、NIST20 スペクトルライブラリや Wiley 11 バージョン GC-MS データベースなどの市販の GC-MS データベースとクロスチェックされています 68,69。 3 つの固有のフラグメントイオンが選択され、ピーク面積値を統合するために使用され、必要に応じていくつかの代謝産物が手動で厳選されました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

この研究の結果を裏付ける全ゲノム配列データは、アクセッション番号 PRJNA783062 で NCBI SRA データベースに寄託されています。 PP_2569 には、リンク https://www.uniprot.org/uniprotkb/Q88JS8/entry を使用して Uniprot データベースにアクセスできます。ソースデータはこのペーパーに付属しています。

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この著作物の一部は、契約番号 DE-AC36-08GO28308 に基づき、米国エネルギー省 (DOE) の国立再生可能エネルギー研究所の管理者および運営者である Alliance for Sustainable Energy, LLC によって執筆されました。この研究の一部は、契約 DE-AC05-00OR22725 に基づいて米国エネルギー省のために UT-Battelle, LLC によって管理されているオークリッジ国立研究所によって部分的に執筆されました。この研究の一部は、生物環境研究局が後援する DOE 科学局のユーザー施設である EMSL (grid.436923.9) を使用して、パシフィックノースウェスト国立研究所 (PNNL) で実施されました。 PNNL は、契約 DE-AC05-76RLO 1830 に基づいてエネルギー省 (DOE) のバテルによって運営されているマルチプログラム国立研究所です。資金は米国エネルギー省エネルギー効率・再生可能エネルギー局バイオエネルギー技術局 (BETO) から提供されました。アジャイルバイオファウンドリ。 Stefan Haugen、William Michener、Morgan Ingraham、Kelley Hestmark の分析への取り組みに感謝します。成長曲線フィッティングツール FittR については、テキサス大学サウスウェスタン医療センターの Scott Saunders 氏に感謝します。 Pymol に関して協力してくれた Eugene Kuatsjah に感謝します。原稿を批判的に読んでくださったロスアラモス国立研究所のタラカ・デール氏に感謝します。 DOE の Jay Fitzgerald 氏と Gayle Bentley 氏、長岡技術科学大学の正井英治教授、Kevin McNaught 氏、および有益な議論をしていただいた Agile BioFoundry のメンバーに感謝します。

再生可能資源および可能科学センター、国立再生可能エネルギー研究所、ゴールデン、コロラド州、80401、米国

チェン・リン、ダヴィニア・サルバチュア、コリン・M・クノイカー、クリストファー・H・カルベイ、ミシェル・A・モニンガー、ケルシー・J・ラミレス、ピーター・C・セント・ジョン、ショーン・P・ウッドワース、クリストファー・W・ジョンソン、グレッグ・T・ベッカム

Agile BioFoundry、エメリービル、カリフォルニア州、94608、米国

チェン・リン、ジョージ・L・ピーボディ、ダヴィニア・サルバチュア、ヨンモ・キム、コリン・M・ノイッカー、ミシェル・A・モニンガー、ナタリー・ムニョス・ムニョス、ブレントン・C・ポワリエ、ケルシー・J・ラミレス、ピーター・C・セントジョン、ショーン・P・ウッドワース、ジョン・K・マグナソン、クリスティン・E・バーナム＝ジョンソン、アダム・M・ガス、クリストファー・W・ジョンソン、グレッグ・T・ベッカム

バイオサイエンス部門、オークリッジ国立研究所、オークリッジ、テネシー州、37831、米国

ジョージ・L・ピーボディ＆アダム・M・ガス

パシフィックノースウェスト国立研究所、リッチランド、ワシントン州、99352、米国

ヨンモ・キム、ナタリー・ムニョス・ムニョス、ブレントン・C・ポワリエ、ジョン・K・マグナソン、クリスティン・E・バーナム＝ジョンソン

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CL、GLP、AMG、CWJ、GTBがプロジェクトコンセプトを策定した。 CL、GLP、DS、AMG、CWJ、および GTB は実験を設計しました。 CL、GLP、CHC はプラスミド DNA 構築と P. putida 株構築を行った。 CL、GLP、MAM はプレートリーダーと振盪フラスコ実験を実施しました。 CMKはバイオリアクター培養を実施しました。 Y.-MK、NMM、BCP、JKM、および KEB-J。メタボロミクスデータを作成しました。 PSJは代謝モデリングを実施しました。 KJR と SPW は分析物の定量化を実行しました。 CL、GLP、DS、CMK、Y.-MK がデータ分析を実施しました。 CL、DS、AMG、CWJ、GTBが原稿を書きました。

アダム・M・ガス、クリストファー・W・ジョンソン、またはグレッグ・T・ベッカムへの通信。

CL、GTB、CWJ、AMG、GLP、および DS は、リグノセルロース糖からのムコン酸生成に関する米国仮特許 (出願番号 63/321332) の発明者です。残りの著者は競合する利益を宣言していません。

Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれた田中勉氏と他の匿名の査読者に感謝します。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Ling、C.、Peabody、GL、Salvachúa、D. 他。進化と代謝工学によるシュードモナス・プチダにおけるグルコースとキシロースからのムコン酸生産。 Nat Commun 13、4925 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41467-022-32296-y

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受信日: 2021 年 11 月 10 日

受理日: 2022 年 7 月 25 日

公開日: 2022 年 8 月 22 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-32296-y

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